[發明專利]一種檢測鈣骨素的試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202210257686.7
• 申請日: 2022-03-16
• 公開（公告）號: CN114460309A
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發明（設計）人: 趙科
• 申請（專利權）人: 北京豪邁生物工程股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/537;G01N21/76
• 代理公司: 北京維正專利代理有限公司 11508
• 代理人: 相黎超

1.一種檢測鈣骨素的試劑盒，其特征在于，包括校準品、生理鹽水、R1試劑、R2試劑以及R3試劑；其中，所述R1試劑包括能夠與人全血中的紅細胞特異性結合的抗紅細胞抗體以及能夠結合抗紅細胞抗體的磁分離試劑；所述R2試劑包括HRP標記的BGP單抗的溶液；所述R3試劑包括Acridan標記的BGP單抗的溶液；所述校準品包括包括濃度為0 ng/mL、2.5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL的骨鈣素抗原溶液。

2.根據權利要求1所述的一種檢測鈣骨素的試劑盒，其特征在于，所述磁分離試劑的制備方法包括以下步驟：將粒徑為1-3 um的羧基磁珠，經第一緩沖液清洗，隨后利用EDC試劑活化，接著進行稀釋，即得到磁分離試劑。

3.根據權利要求2所述的一種檢測鈣骨素的試劑盒，其特征在于，所述R1試劑的制備方法包括以下步驟：

S1-1、于所述磁分離試劑中加入所述抗紅細胞抗體，單位體積的所述羧基磁珠中所述抗紅細胞抗體的加入量為6-10 mg/mL，充分混勻后反應28-32 min，使得所述抗紅細胞抗體和所述羧基磁珠交聯，得到第一交聯液；

S1-2、于所述第一交聯液中加入含有胺基的氨基酸溶液，以使所述羧基磁珠上未反應的活化氨基酸位點完全反應，隨后經磁吸附處理，于固相得到交聯后的羧基磁珠-抗紅細胞抗體復合物；

S1-3、用第二緩沖液對所述羧基磁珠-抗紅細胞抗體復合物進行清洗后，于固相內加入所述第二緩沖液，即得到所述R1試劑，其中，所述R1試劑中所述抗紅細胞抗體的濃度為1.1-1.5 mg/L。

4.根據權利要求1所述的一種檢測鈣骨素的試劑盒，其特征在于，所述HRP標記的BGP單抗溶液的制備方法包括以下步驟：

S2-1、取質量比為1:（1.2-1.3）的BGP單抗和HRP分別做脫鹽處理后，將分別含有兩種蛋白質的溶液混合并濃縮，得到第一濃縮液，所述第一濃縮液中含有BGP單抗和HRP；

S2-2、于所述第一濃縮液里加入BS3試劑，并在水浴環境下反應，使得BGP單抗和HRP交聯，得到第二交聯液，所述第二交聯液中含有HRP標記的BGP單抗；其中，所述BS3試劑和BGP單抗的質量比為（0.4-0.5）：1；

S2-3、于所述第二交聯液中加入含有胺基的氨基酸溶液，使得未反應的活化氨基酸位點完全反應；

S2-4、對步驟S2-3最終獲得的溶液進行蛋白純化，收集HRP標記的BGP單抗的第一純化液并濃縮，使得濃縮液中HRP標記的BGP單抗的濃度為0.9-1.0 mg/mL，即得HRP標記的BGP單抗溶液。

5.根據權利要求4所述的一種檢測鈣骨素的試劑盒，其特征在于，所述R2試劑的制備方法包括以下步驟：于所述HRP標記的BGP單抗溶液中加入第三緩沖液，使得所述HRP標記的BGP單抗的濃度為0.015-0.025 mg/L，最終得到的溶液即為所述R2試劑。

6.根據權利要求1所述的一種檢測鈣骨素的試劑盒，其特征在于，所述Acridan標記的BGP單抗溶液的制備方法包括以下步驟：

S3-1、取BGP單抗進行脫鹽處理，得到脫鹽處理的BGP單抗溶液；

S3-2、將所述脫鹽處理的BGP單抗溶液濃縮后，BGP單抗的濃度為5-7 mg/mL；隨后加入交聯劑Acridan試劑反應后，得到第三交聯液，所述第三交聯液中含有Acridan標記的BGP單抗；其中，所述Acridan試劑和BGP單抗的質量比為（0.15-0.25）：1；

S3-3、于所述第三交聯液中加入含有胺基的氨基酸溶液，使得溶液內未反應的活化氨基酸位點完全反應；

S3-4、將步驟S3-3最終得到的溶液進行脫鹽處理后，即得到Acridan標記的BGP單抗溶液，其中，Acridan標記的BGP單抗濃度為0.9-1.0 mg/mL。

7.根據權利要求6所述的一種檢測鈣骨素的試劑盒，其特征在于，所述R3試劑的制備方法包括以下步驟：于所述Acridan標記的BGP單抗中加入第四緩沖液，使得Acridan標記的BGP單抗的濃度為0.015-0.025 mg/L，最終得到的溶液即為得到R3試劑。

8.權利要求1-7任一所述的一種檢測鈣骨素的試劑盒的檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

Ⅰ、取人全血樣本，隨后于人全血樣本中加入所述生理鹽水和所述R1試劑，在反應時間大于3 min后，進行磁分離處理，收集液相；

Ⅱ、于所述液相中加入所述R2試劑和所述R3試劑，在35-37℃的條件下孵育5-7 min后，實現BGP和HRP標記的BGP單抗、Acridan標記的BGP單抗的同時交聯，得到第四交聯液，所述第四交聯液中含有HRP標記的BGP單抗-BGP-Acridan標記的BGP單抗的復合物；

Ⅲ、準備激發液和隔離液，于所述第四交聯液中加入所述激發液和所述隔離液后，測定發光值即可；

Ⅳ、以所述標準品為待測樣品，進行步驟Ⅰ-Ⅲ，測定其發光值并進行標準曲線的繪制，并根據標準曲線的線性方程計算人全血樣本中BGP的含量。