[發明專利]新型冠狀病毒特異性單克隆抗體的制備及其應用

有效

• 申請號: 202210249216.6
• 申請日: 2022-03-10
• 公開（公告）號: CN114315990B
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 張海江;張堯;李亞坤;劉蕓;楊增敏;楊秀芬;高文雙;伍樹明;王建英;劉永江
• 申請（專利權）人: 北京康樂衛士生物技術股份有限公司
• 主分類號: C07K14/165
• 分類號: C07K14/165;C07K16/10;C12N5/20;G01N33/569
• 代理公司: 北京知文通達知識產權代理事務所(普通合伙) 16051
• 代理人: 歐陽石文

本發明針對新型冠將病毒S蛋白設計多肽，先與血藍蛋白KLH融合作為抗原，免疫小鼠后取小鼠脾臟細胞和SP20融合，經過篩選培養基的篩選以及擴大培養，ELISA法檢測，獲得3株特異性識別新型冠狀病毒S蛋白484賴氨酸的小鼠單克隆抗體。該單抗除了可以應用于SARS?CoV?2病毒的S蛋白第484位點是否存在從酪氨酸到賴氨酸的突變(例如新型冠病毒南非突變株)的檢測試劑盒，還可以應用于相關疫苗研發過程中的鑒別實驗等。

技術領域

本發明涉及醫藥領域，具體涉及新型冠狀病毒特異性單克隆抗體的制備及其應用，更具體涉及新型冠狀病毒S蛋白的特異性單克隆抗體及制備方法和用途。

背景技術

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由一種新的β冠狀病毒-新型冠狀病毒(SARS-CoV-2病毒)引起新型冠狀病毒肺炎簡稱“新冠肺炎”，是指2019新型冠狀病毒（COVID-19，SARS-CoV-2）感染導致的肺炎。新型冠狀病毒屬于β屬的新型冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60-140 nm。新冠病毒(SARS-CoV-2)有四種主要的結構蛋白：刺突蛋白（Spike protein，S蛋白），核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N蛋白），膜蛋白（Membrane protein，M蛋白），包膜蛋白（Envelope protein，E蛋白）。

目前，已經成功上市的新冠疫苗，除了全病毒的滅活疫苗，都集中于S蛋白有關的亞單位疫苗的開發。新型冠狀病毒容易突變，目前流行的突變株501Y.V2(南非突變株，B.1.351)和501Y.V3(巴西突變株，P.1)，其中一個重要突變就是S蛋白的484位氨基酸的突變，從原型株的谷氨酸（484E）突變成了賴氨酸（484K）。

因此，研發特異性識別該賴氨酸突變的小鼠單克隆抗體，不僅可以用于特異的檢測484K突變的新型冠狀病毒，還可以用于484K突變的新型冠狀病毒疫苗研發過程中的鑒別，檢測等。目前所有的研究者都是基于蛋白免疫原獲得型特異抗體，但是獲得率極低，獲得的抗體交叉性強，不能有效識別特定的型別。本發明為了解決現有技術的這一個缺陷，設計了特定的免疫原，獲得了三株型特異性抗體。

發明內容

本發明的目的是研制特異性識別該位點賴氨酸的單克隆抗體，首先設計該位點為賴氨酸的多肽作為免疫多肽，同時，再設計該位點為谷氨酸的多肽作為檢測多肽；多肽免疫小鼠后，除了選擇血清滴度高的小鼠，優選選擇識別免疫多肽和南非突變株RBD蛋白信號比對應的檢測多肽和WT RBD蛋白信號值高的小鼠進行融合；在后續的克隆篩選中，也是優選選擇識別免疫多肽和南非突變株蛋白信號強的克隆，最終篩選出10株陽性克隆。進一步研究發現，其中CoV 77D5、CoV 79G10、CoV 79A5這3株克隆識別免疫多肽比檢測多肽信號明顯強，由于免疫多肽和檢測多肽的唯一差別就是賴氨酸和谷氨酸，可以確認該三株小鼠單克隆抗體為特異性識別新型冠狀病毒S蛋白484賴氨酸的抗體。

本發明提供一種新型冠狀病毒多肽抗原，其特征在于，其是有新型冠狀病毒S蛋白中以CNGVKGFN為核心序列的隨機長8-25個氨基酸的多肽。其中最大范圍是：RDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQS，最小范圍是：CNGVKGFN。在這個范圍的大小是隨機選擇的，多肽一般選擇15-20個附近數量的氨基酸。

優選地，進一步與血藍蛋白KLH偶聯作為抗原多肽，更優選采用4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯作為耦聯劑。

在一個具體實施方式中，其氨基酸序列為RDISTEIYQAGSKPCNGVKGFNCYFPLQS；或者為CNGVKGFN。

本發明由此提供所述的新型冠狀病毒多肽抗原在制備新型冠狀病毒抗體中的應用。