[發明專利]一種基于蛋白冠的血清高豐度蛋白去除方法

在審

• 申請號: 202210233280.5
• 申請日: 2022-03-10
• 公開（公告）號: CN114791466A
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 張珺哲;孟雨晴;王繼剛;劉艷青;朱永平;谷麗維;夏斐;史巧莉;邱崇;陳嘉鋆;張昕煒
• 申請（專利權）人: 中國中醫科學院中藥研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/08;G01N30/72
• 代理公司: 北京君尚知識產權代理有限公司 11200
• 代理人: 司立彬

本發明公開了一種基于蛋白冠的血清高豐度蛋白去除方法，其步驟包括：1)制備氧化鐵納米顆粒IONPs，并將所制備IONPs用超純水定容，得到IONPs儲備液；2)將提取的血清稀釋后加入IONPs儲備液，于室溫條件下震蕩孵育，使IONPs表面吸附血清蛋白，形成蛋白冠PC；3)對步驟2)所得溶液進行磁分離，使PC從溶液中分離；4)清洗PC，以去除溶液管中吸附不穩定的PC和管壁上殘留的血清蛋白；5)對步驟4)清洗后的PC上的蛋白進行蛋白酶切；6)洗脫酶切后的肽段；7)對步驟6)所得的肽段溶液樣品進行樣品脫鹽、樣品轉移，得到去除高豐度蛋白的血清肽段樣品。本發明能夠有效的去除血清中高豐度蛋白。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于蛋白冠的血清高豐度蛋白去除方法。

背景技術

對血清中蛋白含量水平變化的檢測可以反映出機體的健康狀態、是否感染疾病以及給予藥物后對機體的影響。血清蛋白的組成具有高度復雜性，而其中的高豐度蛋白嚴重影響了低豐度蛋白的檢出，無法全面、系統、有效地反映機體的真實情況，這極大限制血清樣品所提供的生物學信息。

目前研究表明，血清蛋白組成相當復雜(含量變化范圍約10個數量級)，主要由體內組織或感染微生物、寄生蟲等分泌，血清蛋白組的變化反映了藥物暴露、條件或疾病對機體的影響，這些血清蛋白也被稱為蛋白質生物標志物。但是血清中的20種高豐度蛋白占有血清總蛋白99％以上的比重，包括白蛋白(50-55％)、免疫球蛋白、轉鐵蛋白、載脂蛋白等。而剩余的1％是由10000多種低豐度蛋白組成(含量大部分處于μg/L和ng/L水平)，且不包括轉錄后修飾的蛋白。因此，血清蛋白組學是目前最復雜且最難分析的蛋白組學。目前，液相色譜-質譜聯用技術(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS)是提高血清蛋白組學研究廣度和深度的最常用手段。然而，在分析過程中所有血清蛋白的肽段碎片會根據自身性質隨溶劑的極性梯度被洗脫進入儀器，被共洗脫的血清高豐度蛋白信號會嚴重影響低豐度蛋白信號的檢測，最終導致血清蛋白鑒定個數不足以有效反映機體情況。因此，從血清樣品中去除高豐度蛋白或富集低豐度蛋白是提高血清蛋白組學的廣度和深度的最前端，也是最有效的手段。

蛋白冠(Protein corona,PC)是由蛋白質和納米顆粒(Nanoparticles,NPs)表面之間的氫鍵、靜電力、溶劑力和范德華相互作用形成的。研究表明這個過程是具有一定無差別性的，可以在一定程度實現血清中高豐度蛋白的去除或者低豐度蛋白的富集。氧化鐵納米顆粒(Iron oxide nanoparticles,IONPs)是一種具有良好磁性和生物相容性的納米材料，已在生物醫學領域具有廣泛的應用研究，可用于造影診斷、組織修復、光熱治療、藥物載體等。IONPs特有的磁性可以使其在形成PC后借助外加磁場進行分離，不僅避免了常規離心方法導致PC分離不純的問題，而且利用相對溫和的磁力可以避免因離心力導致蛋白團聚而造成的樣品損失。

目前商品化的方法采用高豐度蛋白去除離心柱方法(品牌：Thermo Scientific；貨號：A36369)，其通過與2mL離心管配套使用，將10uL血清樣品負載于離心柱上，用不同溶劑配合離心機實現高豐度蛋白的去除。現有商品化的高豐度蛋白去除離心柱的主要缺點如下：

1)成本高：商品化離心柱套裝目前有2種規格，2802元/6根和8477元/24根，最便宜的一根高于350元(處理一個血清樣品)，對大批量樣品進行處理成本過高；

2)存在樣品損失：離心和過柱子方法可能會造成部分蛋白變性團聚，在蛋白重懸和酶解過程種可能無法進行高效的碎片化，造成樣品損失。

發明內容

針對現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種基于蛋白冠的血清高豐度蛋白去除方法。本發明結合PC和LC-MS技術有效的實現血清中高豐度蛋白的去除和低豐度蛋白的富集，從血清樣品中鑒定到更多種類的蛋白，進而提高血清蛋白組學的廣度和深度。

本發明的技術方案為：