[發明專利]人多能干細胞向多譜系大腸類器官定向分化的方法

有效

• 申請號: 202210215178.2
• 申請日: 2022-03-07
• 公開（公告）號: CN114317415B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 吳迪;葛嘯虎;曹寧;王莉莉;李慧芳;徐迎;王思思;羅曉琴
• 申請（專利權）人: 天九再生醫學（天津）科技有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/071
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 馬云云

1.一種人多能干細胞向多譜系大腸類器官定向分化的方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：

S1、待hPSC匯合度達30-40%，誘導hPSC分化定形內胚層；

S2、誘導定形內胚層分化為后腸管衍生物，且得到的后腸管衍生物為高表達CDX2的2D細胞層；

S3、將得到的后腸管衍生物機械破碎后，誘導后腸管衍生物分化為多譜系大腸類器官；

其中，S1中誘導培養基包括培養基A和培養基B，培養基A包括基礎培養基及添加組分，添加組分包括：rhGDF8、GSK-3抑制劑，基礎培養基為含有體積占比2% 的SM1型神經營養添加劑的RPMI-1640；培養基B包括基礎培養基及添加組分，添加組分包括：rhGDF8，基礎培養基為含有體積占比2%的SM1型神經營養添加劑的RPMI-1640；具體的，培養基A中添加組分的含量為100ng/ml的rhGDF8、4μM的CHIR99021，CHIR99021為GSK-3抑制劑；培養基B中添加組分的含量為100ng/ml的rhGDF8，且在培養基A和培養基B中均分化1天；

S2中誘導培養基包括培養基C和培養基D，培養基C包括基礎培養基及添加組分，添加組分包括：rhFGF4、WNT激活劑，基礎培養基為含有體積占比2% 的SM1型神經營養添加劑的Ad-F12；培養基D包括基礎培養基及添加組分，添加組分包括：BMP激活劑、rhEGF、GSK-3抑制劑，基礎培養基為含有體積占比2%的SM1型神經營養添加劑的Ad-F12；具體的，培養基C中添加組分的含量為500ng/ml的rhFGF4、250ng/ml的rhWnt3a，rhWnt3a為WNT激活劑；培養基D中添加組分的含量為200nM的SJ000291942、100ng/ml的rhEGF、3μM的CHIR99021，CHIR99021為GSK-3抑制劑，SJ000291942為BMP激活劑，且在培養基C和培養基D中均分化3天；

S3中誘導培養基包括培養基E，培養基E包括基礎培養基及添加組分，添加組分包括：rhEGF、BMP I型受體抑制劑、GSK-3抑制劑，基礎培養基為含有體積占比2%的SM1型神經營養添加劑的Ad-F12；具體的，培養基E中添加組分的含量為100ng/ml的rhEGF、500nM的LDN193189、3μM的CHIR99021，LDN193189為BMP I型受體抑制劑，CHIR99021為GSK-3抑制劑，且在培養基E中分化30天。

2.根據權利要求1所述的人多能干細胞向多譜系大腸類器官定向分化的方法，其特征在于：機械破碎包括一級機械破碎與二級機械破碎；

一級破碎方法為：使用移液器吸頭橫縱向刮碎衍生物，并將其轉移至無菌EP管中，形成懸液；

二級破碎方法為：使用注射器緩慢吹吸懸液3次，期間鏡檢，使其破碎為50-100μm的細胞團塊；此后，使用Cultrex-Type2基質膠進行3D包被。

3.一種試劑盒在誘導人多能干細胞向多譜系大腸類器官定向分化上的應用，其特征在于：該試劑盒包括培養基A、培養基B、培養基C、培養基D和培養基E，該試劑盒的操作步驟如下：

S1、待hPSC匯合度達30-40%，使用培養基A和培養基B分步誘導hPSC分化定形內胚層；

培養基A包括基礎培養基及添加組分，添加組分包括：rhGDF8、GSK-3抑制劑，基礎培養基為含有體積占比2% 的SM1型神經營養添加劑的RPMI-1640；培養基B包括基礎培養基及添加組分，添加組分包括：rhGDF8，基礎培養基為含有體積占比2%的SM1型神經營養添加劑的RPMI-1640；具體的，培養基A中添加組分的含量為100ng/ml的rhGDF8、4μM的CHIR99021，CHIR99021為GSK-3抑制劑；培養基B中添加組分的含量為100ng/ml的rhGDF8，且在培養基A和培養基B中均分化1天；

S2、使用培養基C和培養基D分步誘導定形內胚層分化為后腸管衍生物，且得到的后腸管衍生物為高表達CDX2的2D細胞層；

培養基C包括基礎培養基及添加組分，添加組分包括：rhFGF4、WNT激活劑，基礎培養基為含有體積占比2% 的SM1型神經營養添加劑的Ad-F12；培養基D包括基礎培養基及添加組分，添加組分包括：BMP激活劑、rhEGF、GSK-3抑制劑，基礎培養基為含有體積占比2%的SM1型神經營養添加劑的Ad-F12；具體的，培養基C中添加組分的含量為500ng/ml的rhFGF4、250ng/ml的rhWnt3a，rhWnt3a為WNT激活劑；培養基D中添加組分的含量為200nM的SJ000291942、100ng/ml的rhEGF、3μM的CHIR99021，CHIR99021為GSK-3抑制劑，SJ000291942為BMP激活劑，且在培養基C和培養基D中均分化3天；

S3、將得到的后腸管衍生物機械破碎后，使用培養基E誘導后腸管衍生物分化為多譜系大腸類器官；

培養基E包括基礎培養基及添加組分，添加組分包括：rhEGF、BMP I型受體抑制劑、GSK-3抑制劑，基礎培養基為含有體積占比2%的SM1型神經營養添加劑的Ad-F12；具體的，培養基E中添加組分的含量為100ng/ml的rhEGF、500nM的LDN193189、3μM的CHIR99021，LDN193189為BMP I型受體抑制劑，CHIR99021為GSK-3抑制劑，且在培養基E中分化30天。