[發明專利]一種異亮氨酸生產方法、乙酰羥酸合酶突變體及重組微生物與應用

在審

• 申請號: 202210157056.2
• 申請日: 2022-02-21
• 公開（公告）號: CN116656754A
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發明（設計）人: 吳濤;薛婷莉;姚嘉琪;欒明月;胡丹;趙津津;李巖
• 申請（專利權）人: 廊坊梅花生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12P13/06
• 分類號: C12P13/06;C12N9/88;C12N15/60;C12N1/21;C12N15/77;C12P13/08;C12R1/15
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 孫怡

本發明涉及微生物工程技術領域，具體公開了一種異亮氨酸生產方法、乙酰羥酸合酶突變體及重組微生物與應用。本發明的異亮氨酸生產方法，包括以重組微生物進行發酵培養的步驟，所述重組微生物相比于出發菌株，表達乙酰羥酸合酶ilvIH或乙酰羥酸合酶突變體ilvH^F134L、ilvH^F134V或ilvH^F134A；所述重組微生物的出發菌株為棒桿菌。本發明生產異亮氨酸的方法，生產效率高，副產物少，適于工業化推廣。

技術領域

本發明涉及微生物工程技術領域，具體地說，涉及一種異亮氨酸生產方法、乙酰羥酸合酶突變體及重組微生物與應用。

背景技術

已知支鏈氨基酸(例如：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)在各種工業應用中用于生產各種產品，例如人類營養增強劑，動物飼料添加劑，醫療產品成分和化妝品成分。支鏈氨基酸的生產方法有三種：提取法、化學合成法、微生物發酵法。提取法和化學合成法由于原料來源受限制、生產成本高、污染環境，難以實現工業化生產。微生物發酵法具有原料成本低、反應條件溫和、容易實現大規模生產等優點，是目前支鏈氨基酸最主要的方法。但因菌種的發酵性能仍較差，且副產物較高，導致轉化率仍較低，不能滿足大規模工業化生產的需求。

支鏈氨基酸的生物合成具有共同的前體物(丙酮酸)和相同的酶(乙酰羥酸合酶)，因此難以通過微生物發酵生物合成單一種類的支鏈氨基酸。乙酰羥酸合酶是支鏈氨基酸生物合成的第一個酶，也是支鏈氨基酸生物合成的關鍵酶，催化兩分子丙酮酸生成乙酰乳酸(乙酰乳酸是纈氨酸和亮氨酸的前體物)，同時也催化a-酮基丁酸和丙酮酸生成a-乙酰羥基丁酸(a-乙酰羥基丁酸是異亮氨酸的前體物)。因此，乙酰羥酸合酶是支鏈氨基酸生物合成非常重要的酶。

乙酰羥酸合酶由兩個亞基組成，分別是大亞基和小亞基，大亞基具有催化活性，小亞基起到反饋抑制的調控作用，受纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的反饋抑制。在谷氨酸棒桿菌中，大亞基由ilvB基因編碼，小亞基由ilvN基因編碼；而在大腸桿菌中，大亞基由ilvI基因編碼，小亞基由ilvH基因編碼。中國專利CN?110506112?A、CN?110724679A報道了乙酰羥酸合酶突變體、包含其的微生物和用其生產L-支鏈氨基酸的方法，公開了乙酰羥酸合酶大亞基IlvB蛋白的突變體。中國專利CN201610647430.1報道了一種谷氨酸棒狀桿菌及應用，公開了乙酰羥酸合酶小亞基IlvN蛋白的突變體。仍有必要進一步對支鏈氨基酸的生物合成進行研究，以提供一種新的提升支鏈氨基酸中異亮氨酸產率，并降低副產物纈氨酸、亮氨酸的含量的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種能夠高效率生產支鏈氨基酸的重組微生物及方法。

本發明的技術方案如下：

一種異亮氨酸生產方法，其包括以重組微生物進行發酵培養的步驟，所述重組微生物相比于出發菌株，表達乙酰羥酸合酶ilvIH或乙酰羥酸合酶突變體ilvH^F134L、ilvH^F134V或ilvH^F134A；所述重組微生物的出發菌株為棒桿菌；

乙酰羥酸合酶ilvIH的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.21所示，乙酰羥酸合酶突變體ilvH^F134L的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.22，乙酰羥酸合酶突變體ilvH^F134V的氨基酸序列如SEQID?NO.23所示，乙酰羥酸合酶突變體ilvH^F134A的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.24所示。

本發明將大腸桿菌(Escherichia?coli?str.K-12substr.MG1655)來源的乙酰羥酸合酶(由ilvIH基因編碼)引入出發菌株的細胞內，并在ilvH基因引入特異的突變位點，從而成功創造出了能夠高效生產異亮氨酸的新微生物，進而將其應用到異亮氨酸的生產中，使得能夠高效率地生成異亮氨酸，并且降低了副產物纈氨酸、亮氨酸的含量。