[發明專利]一種多核苷酸、載體元件及表達載體和宿主細胞及應用

在審

• 申請號: 202210140323.5
• 申請日: 2022-02-16
• 公開（公告）號: CN114540352A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 金偉剛;董庸行;宋彥凌
• 申請（專利權）人: 艾瑞生命科學技術（常州）有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/67;C12N5/10;C07K14/82;C07K14/71;C12N9/12
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 俞春雷

本發明公開了一種多核苷酸，所述多核苷酸包括如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本發明的包括如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的多核苷酸，其與細胞的轉錄調控基因有強烈的共參與關系并維持持家基因等高表達基因穩定，將含有其的載體元件導入表達載體可提高宿主細胞轉錄調控因子的辨識度，并進而提高并維持外來基因的表達，最終用以構建穩定且高表達的生產用細胞株。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種多核苷酸、包含該多核苷酸的載體元件、包含該載體元件的表達載體、包含該表達載體的宿主細胞以及該宿主細胞在生產蛋白中的應用。

背景技術

近年來，蛋白質藥物被應用于不同疾病的治療，其中單克隆抗體(mAbs)是發展最快的一類。其中，目前生物藥領域主要使用的哺乳類宿主細胞包含CHO、NSO、SP2/0、HEK等，而在整個單株抗體則以CHO為主要宿主細胞。CHO細胞是生產這些蛋白質藥物應用最廣泛的細胞株，表達載體影響目標蛋白的表達量與表達穩定性。

CHO細胞至少包括如下優點：(1)適合懸浮培養，符合工業大規模生產的需求；(2)糖型修飾與人相似，貼近天然mAbs的結構和功能；(3)外源基因可以穩定地整合到CHO細胞中達到高表達量；(4)非人源細胞，故人源病毒不能感染和擴增；(5)分泌低量的內源蛋白，有利于目的蛋白的分離純化；(6)研究與藥物開發應用歷史完整，故目前的新藥開發仍以CHO細胞為主要平臺。

近幾年的細胞株開發平臺的發展過程中，CHO細胞也不斷地被挑選與改造而衍生出多個細胞系，如DG44、DXB11、CHO-S、CHO-K1與CHOZN等。這些細胞系是經由人工挑選優化、突變篩選或基因工程的方式建立并用于不同的藥物發展與平臺應用。隨著基因改造技術的進步與發現(如：Zinc finger、TALENT與CRISPR)，根據應用需求可以為自有的野生型CHO細胞株進行各項改造已達到產量、提高穩定性或質量的升級。

宿主細胞主要提供蛋白質藥物表達的部分平臺，相應的表達株載體可進一步體現出其生產能力。故挑選適當且符合宿主細胞的載體細胞株構建十分重要。

現有的表達載體的構建策略包括如下步驟：啟動子的挑選(猿猴空泡病毒40(SV40)、延伸因子-1α(EF-1α)和巨細胞病毒(CMV)等)；篩選基因的選擇(谷氨酰胺合成酶基因(glutaminesynthetase,GS)、L-氨基亞砜蛋氨酸(Methionine Sulphoximine，MSX)、二氫葉酸還原酶(dhfr)(MTX)和抗嘌呤霉素(Puromycin)基因等)；表基因調控元件的使用(UCOE和MAR等)；載體元件的排列(單順反子載體、多啟動子表達載體、IRES(內部核糖體進入位點)或Furin-2A(弗林蛋白酶-2A多肽)元件介導的三順反子載體)。將上述啟動子、終結子與篩選基因進行基礎排列便形成原型載體。

除了以上數種必要元件，添加如UCOE和MAR的特殊基因組開放區于表達載體也是可應用的方向。基因組開放區具有如下特點：來源于真核生物，相關基因具穩定高表達的特性與基因組區間含大量的表基因修飾。這樣的特點可有效率的構建符合蛋白質藥物工業生產用細胞株，同時縮短蛋白質藥物臨床前研究的時間。將基因組開放區置入原型載體中便形成具高表達與穩定性的哺乳類細胞表達載體。

以下簡單介紹幾種較為常用的載體：

(1)ThermoFisher

pcDNA系列載體：主要架構為啟動子、終結子與篩選基因基本串聯。試用多數哺乳類細胞表達，但穩定性較差。

pCHO-1.0：主要架構為啟動子、終結子與篩選基因基本串聯。該載體的特點是使用優化的啟動子(重組)使其便于CHO細胞抗體藥物的表達。

(2)LonzoVectors system：主要架構為啟動子、終結子與篩選基因。該篩選系統以GS篩選為主要篩選標記，載體進一步添加transposon等元件使細胞株開發效率提升。