[發明專利]一種外周血單個核細胞制備肝臟類器官的方法

在審

• 申請號: 202210130603.8
• 申請日: 2022-02-11
• 公開（公告）號: CN114561335A
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: 項鵬;柯瓊;范明明;李偉強
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/074
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 段卉

本發明公開了一種外周血單個核細胞(PBMCs)制備肝臟類器官的方法，本發明通過一種相對無創的方式獲得具有個體遺傳信息的，在體外充分模擬肝臟發育及肝臟相關疾病病理生理過程的肝臟類器官模型。將采集的PBMCs通過重編程為誘導多能干細胞(iPSCs)，進一步iPSCs誘導分化為肝臟類器官，通過這兩大步驟實現上述目標，且iPSCs可在體外無限擴增及保存，為肝臟類器官的規模化生產提供了基礎。

技術領域

本發明涉及干細胞技術領域，具體地，涉及一種外周血單個核細胞制備肝臟類器官的方法。

背景技術

肝臟是人體最大的代謝器官，基于肝臟的遺傳代謝性疾病種類繁多，包括脂肪肝、先天性膽道閉鎖、檸檬素缺乏癥、α-1抗胰蛋白酶缺乏癥、酪氨酸血癥Ⅰ型、肝豆狀核變性等等。這些肝臟疾病的發生發展研究需要良好的體內外模型，雖然國內外已根據各種疾病構建了多種動物模型，但是動物和人類在發育、生理結構和病理狀態等方面存在較大差異，動物模型很難復制人類疾病的進展，因此亟需更優的疾病模型出現。

此時誘導多能干細胞的出現解決了這一問題，將具有患者遺傳背景的多能干細胞系定向分化為類器官，可為遺傳代謝疾病的個體化研究提供完整的發育及病理生理模型，為藥物的篩選、基因治療的實現提供更加安全的體外疾病模型。

同時，目前階段，終末期肝病的唯一治愈手段只有肝臟移植，但供肝的短缺、移植后的免疫排斥反應及昂貴的費用把大部分患者攔在了治愈的門外。肝臟類器官也許是解決這一難題的重要突破點，將患者來源的肝臟類器官在體外擴增培養既可以解決供肝的短缺，也可以解決移植后排斥的問題。雖然現階段類器官的培養昂貴且仍有很多不足，但未來可期。

誘導肝臟類器官的原理是獲得肝臟祖細胞或者肝臟干細胞，由肝祖細胞或者肝干細胞進一步誘導分化為具有3D結構的肝臟類器官。目前獲取人肝臟干細胞的方式主要有兩種：

一種是從人體肝臟組織中通過分離培養獲取的原代肝干細胞，但是獲得肝臟組織是有創操作，尤其是對于肝功能異常或者衰竭的患者來說，肝穿刺或者肝切除等有創操作會大大增加出血風險或進一步加重肝功能惡化，因此獲得肝臟組織有限而且困難。

另外一種重要的方式是模擬人體發育的過程，由人誘導多能干細胞(inducedpluripotent stem cell，iPSCs)通過誘導分化獲得，由于iPSCs可以由志愿者外周血單核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)重編程獲得，采血的過程簡單且相對無創，因此由外周血單核細胞重編程得到iPSCs，后再由iPSCs進一步誘導分化取得可以傳代和擴增的人類肝臟類器官，這也許將是未來替代人類肝臟器官的重要來源。

發明內容

目前已經存在肝臟類器官誘導方案是從原代肝臟祖細胞或者干細胞誘導得來，這種誘導方案雖可以獲得和捐獻者具有相同遺傳背景的肝臟類器官，但是取材方式創傷過大，尤其是對于已經存在肝臟疾病或者肝衰竭的患者來說，風險極大。且原代來源的肝臟祖細胞或者干細胞在體外難以穩定擴增及保持其干細胞特性，如需要再次誘導仍需反復取材。本發明的目的是為了克服現有技術的上述不足，提供一種外周血單個核細胞制備肝臟類器官的方法。本發明解決了這一難題，即通過一種相對無創的方式獲得具有個體遺傳信息的，可以在體外充分模擬肝臟發育及肝臟相關疾病病理生理過程的肝臟類器官模型，且誘導多能干細胞可在體外無限擴增及保存，為肝臟類器官的反復及規模化生產提供了基礎。

因此本發明的第一個目的是提供一種肝祖細胞球的增殖培養基。

本發明的第二個目的是提供一種肝臟類器官的誘導培養基。

本發明的第三個目的是提供所述肝祖細胞球的增殖培養基和/或、肝臟類器官的誘導培養基在制備肝臟類器官中的應用。

本發明的第四個目的是提供一種多能干細胞細胞制備肝臟類器官的方法。

本發明的第五個目的是提供任一所述方法制備得到的肝臟類器官。