[發明專利]一種外周血單個核細胞制備肝臟類器官的方法

在審

• 申請號: 202210130603.8
• 申請日: 2022-02-11
• 公開（公告）號: CN114561335A
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發明（設計）人: 項鵬;柯瓊;范明明;李偉強
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/074
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 段卉

1.一種肝祖細胞球的增殖培養基，其特征在于，所述增殖培養基為含有N-2羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、GlutaMAX、乙酰半胱氨酸、N2、B27無血清細胞培養添加劑、煙酰胺、胃泌素、A83-01、Forskolin、R-spondin-1蛋白、Wnt3a蛋白、和表皮細胞生長因子EGF的DMEM/F12基礎培養基。

2.一種肝臟類器官的誘導培養基，其特征在于，所述誘導培養基為含有牛血清白蛋白、B27細胞培養添加劑、ITS細胞培養添加物、L-ascorbic acid trisodium salt、乙酰半胱氨酸、肝細胞生長因子HGF蛋白、抑瘤素M、地塞米松、表皮細胞生長因子EGF蛋白、EGF、8-溴-環磷酸腺苷、維生素K2、石膽酸、和Y27632的HM基礎培養基。

3.權利要求1所述肝祖細胞球的增殖培養基和/或權利要求2所述肝臟類器官的誘導培養基在制備肝臟類器官中的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，在多能干細胞制備肝臟類器官中的應用。

5.一種多能干細胞細胞制備肝臟類器官的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.將多能干細胞誘導分化為末端前腸內胚層細胞；

S2.將末端前腸內胚層細胞在基質膠內重懸，之后用權利要求1所述肝祖細胞球的增殖培養基培養，得到類器官細胞球；

S3.解離并消化上一步的得到的類器官細胞球，用權利要求2所述肝臟類器官的誘導培養基培養。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟S1中，所述多能干細胞是外周血單個核細胞重編程得到的。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟S2中，將末端前腸內胚層細胞在具有基質膠內重懸，所述基質膠形成的膠滴呈立體形狀。

8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟S2中，末端前腸內胚層細胞在基質膠內重懸的方法包括以下步驟：

S21.將末端前腸內胚層細胞消化處理，固液分離，取細胞沉淀；

S22.Matrigel基質膠與沉淀細胞混合，吹吸充分混合，并避免混入氣泡，保持避免基質膠凝固，得到細胞基質膠懸液；

S23.將細胞基質膠懸液加入具有尖底或錐底的容器中，保持在容器的尖底或錐底，孵育至全部基質膠凝固；

S24.吹打尖底或錐底的容器底部的基質膠，轉移至后續培養容器中。

9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟S2中，使用權利要求1所述肝祖細胞球的增殖培養基共培養10～14天；步驟S3中，使用權利要求2所述肝臟類器官的誘導培養基共培養10～14天。

10.權利要求5到9任一所述方法制備得到的肝臟類器官。