[發明專利]大腸桿菌的高密度培養及在催化生產槲皮素中的應用

有效

• 申請號: 202210129181.2
• 申請日: 2022-02-11
• 公開（公告）號: CN114410563B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發明（設計）人: 周景文;單小玉;余世琴;徐沙;曾偉主;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/26;C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了大腸桿菌的高密度培養及在催化生產槲皮素中的應用，屬于發酵工程及生物醫藥技術領域。本發明通過優化發酵培養基，使構建的重組菌株獲得較高濃度的菌體密度，且具有較好的全細胞催化活性。將高密度發酵獲得的重組大腸桿菌作為催化劑進行全細胞催化，可在4?6h內催化40g/L的底物蘆丁完全水解生成槲皮素。

技術領域

本發明涉及大腸桿菌的高密度培養及在催化生產槲皮素中的應用，屬于發酵工程及生物醫藥技術領域。

背景技術

槲皮素是一種黃酮醇，存在于多種蔬菜和草藥中，含有許多有利的生物活性，能幫助健康細胞增殖，提高心血管免疫。槲皮素具備抗氧化屬性，能夠清除自由基，幫助細胞調節，促進DNA完整性等。另外，槲皮素還能幫助身體在氧化應激中保持足夠的谷胱甘肽水平，支持免疫調節。槲皮素在清除自由基方面具有顯著的效果，是藥用植物的活性成分之一，相關藥理和臨床實驗證明槲皮素具有廣泛的藥用價值，現代藥理研究表明槲皮素具有抗炎、抗氧化、抑制腫瘤細胞生長等藥理活性。此外，槲皮素還可以治療慢性支氣管炎、冠心病及高血壓等疾病。槲皮素是許多類黃酮的基礎結構，如蘆丁，異槲皮苷。同時，槲皮素環結構也是更大的類黃酮分子的一部分存在，比如金絲桃中的高糖，銀杏中的黃酮糖苷等。槲皮素比較容易從蘆丁中提取獲得，常常被添加到保健品中。然而，槲皮素很少在自然中直接存在，且在小腸的吸收表面不易被主動吸收，它的吸收只能依靠更慢速、更低效的被動擴散過程進行。

目前，異槲皮素和槲皮素的制備方法有：1.從天然植物中分離提取，如“從生物類黃酮中回收異槲皮素”等方法，但這類方法要使用大量的有機溶劑，不利于清潔生產，并且產率低，成本高，很難實現產業化生產；2.用酶法水解蘆丁制備異槲皮苷和槲皮素，比如“酶法水解制備異槲皮素和槲皮素的方法”，該方法需要使用昂貴的生物酶制劑，工藝設備也較復雜，生產成本較高。槲皮素的工業化生產一般采用強酸水解蘆丁的工藝，對生產設備的防腐要求較高，且產生三廢，不利于環境保護。微生物法比較經濟而且操作方便安全。但是，全細胞催化生產需要足夠的菌體量，如果培養大腸桿菌直接采用TB培養基，容易導致發酵成本太高。因此，為了在減少發酵成本的同時獲得較高菌體量，亟待開發更加高效的發酵方法。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種高密度發酵方法，從而提高重組大腸桿菌發酵的菌體量。

本發明提供了一種能夠利用蘆丁生產槲皮素的重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌表達嗜熱鏈球菌來源的L-鼠李糖苷酶和耐熱β-葡萄糖苷酶。

在一種實施方式中，所述L-鼠李糖苷酶DthRha具有如Genbank登錄號WP_012548615.1所示的氨基酸序列；所述β-葡萄糖苷酶Dth3具有如Genbank登錄號ACI19278.1所示的氨基酸序列。

在一種實施方式中，編碼所述DthRha的基因序列如SEQ?ID?NO.1所示，編碼所述Dth3的基因序列SEQ?ID?NO.2所示。

在一種實施方式中，所述重組大腸桿菌以pET系列載體為中的pRSFduet-1為表達載體。

在一種實施方式中，所述重組大腸桿菌以E.coli?BL21(DE3)為宿主。

本發明還提供含所述重組大腸桿菌的細胞催化劑；所述細胞催化劑包括但不限于所述重組大腸桿菌的細胞培養液或固定化細胞。

本發明還提供了所述重組大腸桿菌的高密度發酵方法，是將所述重組大腸桿菌接種至發酵培養基中，使接種后的OD達0.08以上，于35～37℃發酵，發酵12h時后降溫至30℃，并且開始補料，補料流速為20mL/h；發酵過程溶氧控制為40％，pH為7.0。