[發明專利]一種(β,S)構型羥丙基四氫吡喃三醇的結晶方法

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• 申請號: 202210122284.6
• 申請日: 2022-02-09
• 公開（公告）號: CN114381490A
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發明（設計）人: 韓振玉;張浩;郝振;楊杰
• 申請（專利權）人: 阜陽欣奕華制藥科技有限公司
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P17/06;C07D309/10
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 趙穎

1.一種(β,S)構型羥丙基四氫吡喃三醇的結晶方法，其特征在于，所述(β,S)構型羥丙基四氫吡喃三醇的結晶方法具體包括以下步驟：

(1)在羰基還原酶和輔酶再生酶的存在下，D-吡喃木糖苷-2-(S)丙酮發生不對稱還原反應，得到(β,S)構型羥丙基四氫吡喃三醇的粗品；

(2)將步驟(1)得到的反應體系依次進行萃取、濃縮和結晶，得到(β,S)構型羥丙基四氫吡喃三醇的晶體。

2.根據權利要求1所述的(β,S)構型羥丙基四氫吡喃三醇的結晶方法，其特征在于，步驟(1)中，所述輔酶再生酶包括甲酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶或醇脫氫酶中的任意一種或至少兩種的組合。

3.根據權利要求1所述的(β,S)構型羥丙基四氫吡喃三醇的結晶方法，其特征在于，步驟(1)的具體操作為：將D-吡喃木糖苷-2-(S)丙酮、共底物以及含羰基還原酶和輔酶再生酶液體混合，進行保溫反應，得到含(β,S)構型羥丙基四氫吡喃三醇的粗品的反應液。

4.根據權利要求3所述的(β,S)構型羥丙基四氫吡喃三醇的結晶方法，其特征在于，在反應體系中，所述D-吡喃木糖苷-2-(S)丙酮的濃度為20-1000g/L，優選為100-200g/L；

優選地，所述共底物與含羰基還原酶和輔酶再生酶液體的體積比為(0.5-2):1，優選為1:1；

優選地，所述共底物包括異丙醇水溶液、葡萄糖水溶液或甲酸水溶液中的任意一種或至少兩種的組合，優選異丙醇水溶液；

優選地，所述共底物的質量百分含量為30-50％；

優選地，所述保溫反應的溫度為25-30℃；

優選地，所述保溫反應的時間為8-24h，優選為10-12h。

5.根據權利要求3或4所述的(β,S)構型羥丙基四氫吡喃三醇的結晶方法，其特征在于，所述含羰基還原酶和輔酶再生酶液體由以下制備方法制備得到：

(a)將羰基還原酶和輔酶再生酶重組后，與工程大腸桿菌共同接種于液體培養基中進行培養；

(b)通過對步驟(a)培養得到的體系進行離心，收集菌體；將菌體置于緩沖溶液后破碎，再通過離心收集上清液，得到含羰基還原酶和輔酶再生酶液體；

優選地，步驟(a)中，所述重組具體包括以下步驟：提取基因組、羰基還原酶基因克隆、E.coli/pET-28a(+)-KR01重組工程菌的構建及表達；

優選地，所述提取得到的基因組為Streptomyces cyaneogriseus和Rhodococcusruber DSM 44541基因組；

優選地，所述羰基還原酶基因克隆包括以下步驟：將提取得到的基因組依次通過密碼子優化及化學合成羰基還原酶基因、從微生物基因組中克隆羰基還原酶基因、定點突變克隆羰基還原酶基因，得到pET-28a(+)-LK02和pET-28a(+)-LK03質粒；

優選地，所述E.coli/pET-28a(+)-KR01重組工程菌的構建及表達包括以下步驟：將克隆得到的質粒分別轉化至BL21(DE3)感受態細胞，獲得分別表達KR01、KR02羰基還原酶的重組工程菌。

6.根據權利要求3-5中任一項所述的(β,S)構型羥丙基四氫吡喃三醇的結晶方法，其特征在于，步驟(2)中，所述萃取用溶劑為乙酸乙酯、乙酸甲酯或甲酸甲酯中的任意一種或至少兩種的組合，優選為乙酸乙酯。

7.根據權利要求3-6中任一項所述的(β,S)構型羥丙基四氫吡喃三醇的結晶方法，其特征在于，步驟(2)中，所述結晶的具體步驟為：將濃縮后的產物與結晶溶媒混合后，依次進行攪拌結晶、降溫養晶、過濾、洗滌和干燥，得到(β,S)構型羥丙基四氫吡喃三醇的晶體。