[發(fā)明專利]一種可以用于血液檢測(cè)的PCR反應(yīng)液及其試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210113295.8
• 申請(qǐng)日: 2022-01-30
• 公開（公告）號(hào): CN114134220A
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 牟新濤;劉婉君;韓典霖;楊亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 濟(jì)凡生物科技（北京）有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/686
• 分類號(hào): C12Q1/686
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 趙靜

本發(fā)明公開了一種用于血液直接擴(kuò)增的PCR反應(yīng)液，包括Taq DNA聚合酶、緩沖體系、二價(jià)陽(yáng)離子、一價(jià)陽(yáng)離子、dNTPs、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑和PCR體系穩(wěn)定劑；所述的Taq DNA聚合酶是抗體修飾的熱啟動(dòng)DNA聚合酶、Taq DNA Polymerase中的一種或者兩種混合。本發(fā)明提供的PCR反應(yīng)液可以以全血為模板進(jìn)行擴(kuò)增，也可以在血液存在的情況下，擴(kuò)增其它靶基因，最高可以耐受40%血液。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體一種可以血液為模板直接進(jìn)行PCR檢測(cè)的反應(yīng)液及其試劑盒。

背景技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種敏感的DNA擴(kuò)增程序，可以從復(fù)雜混合物中檢測(cè)特定的核酸。反應(yīng)體系中包含核酸模板，特異性引物、DNA聚合酶及相應(yīng)的緩沖體系及離子。在核酸擴(kuò)增過程中，目的基因、引物和聚合酶混合物在不同的溫度下經(jīng)受連續(xù)熱循環(huán)過程（25～35），擴(kuò)增新的互補(bǔ)目標(biāo)序列。自20世紀(jì)80年代中期以來，PCR已成為檢測(cè)微量核酸的標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)于臨床診斷和法醫(yī)檢測(cè)來說，樣本中的抑制物是造成PCR反應(yīng)中假陰性和低靈敏度的主要問題。

做為臨床上非常重要的血液樣本PCR的分析，與人類健康相關(guān)的遺傳疾病診斷測(cè)試中最大的一部分疾病、病毒和微生物感染、血型和安全血庫(kù)有非常大的相關(guān)性。

血液對(duì)PCR的抑制作用尚未明確，部分研究表明抑制擴(kuò)增的主要原因是DNA聚合酶的失活和/或者捕獲或降解目標(biāo)DNA和原分子。人血液中PCR的幾種主要抑制劑如血紅蛋白、免疫球蛋白G和乳鐵蛋白另外血液蛋白酶活性也可能導(dǎo)致PCR效率的降低(5,9–12)。外源性的抗凝劑包括EDTA、肝素等，對(duì)PCR擴(kuò)增也有一定的抑制作用。

除了上述物質(zhì)可以抑制PCR反應(yīng)外，在全血樣本的特異性檢測(cè)中，通常會(huì)有其它的非特異擴(kuò)增，與靶基因共同競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致目的基因產(chǎn)物不純或者無(wú)法擴(kuò)增。

為了降低血液成分對(duì)PCR的抑制作用，人們開發(fā)了多種DNA提取方法。這些預(yù)處理步驟通常是耗時(shí)、勞動(dòng)密集型和樣本特異性的。此外，即使在提取DNA時(shí)使用試劑盒，一些PCR抑制劑可能仍然無(wú)法完全消除。例如，乙肝病毒檢測(cè)使用血液DNA純化試劑盒約有14%的人可能是假陰性。

目前廣泛使用的DNA聚合酶，如Taq DNA Polymerase和熱啟動(dòng)型Taq Gold，都可以使用低于0.2%的濃度全血進(jìn)行PCR擴(kuò)增。一些非Taq DNA聚合酶，如rTth，Tfl，HotTub和Pwo，能耐受較高濃度的血液。部分Taq突變體，如KT10，T36等可以耐受10-20%血液。通過研究發(fā)現(xiàn)一些試劑加入體系后會(huì)降低血液對(duì)Taq酶的抑制，使Taq酶可以在含2%血液體系中進(jìn)行擴(kuò)增，但是這種效果同樣具有樣本特異性。這些試劑包括，甜菜堿、單鏈結(jié)合蛋白、或者某些蛋白的混合物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種全新的可用于血液直擴(kuò)的PCR反應(yīng)液（Mix2），其最高可以耐受40%血液。本試劑的發(fā)明將有利于利用PCR技術(shù)對(duì)全血樣本進(jìn)行分析檢測(cè)并克服現(xiàn)有PCR技術(shù)存在的上述缺點(diǎn)。

本發(fā)明所提供的PCR反應(yīng)液，包括Taq DNA聚合酶、緩沖體系、二價(jià)陽(yáng)離子、一價(jià)陽(yáng)離子、dNTPs、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑和PCR體系穩(wěn)定劑。

其中，所述的Taq DNA聚合酶是抗體修飾的熱啟動(dòng)DNA聚合酶、Taq DNAPolymerase中的一種或者兩種混合。

進(jìn)一步的，所述抗體修飾的熱啟動(dòng)DNA聚合酶可選自濟(jì)凡生物科技（北京）有限公司出售的下述至少一種：A110、A112和A113。

所述A110：GenFQ II Hot Start Taq DNA Polymerase（商品目錄號(hào)為A110-01或A110-02）；