[發明專利]一種芯片表面固相引物剪切效率的檢測方法

在審

• 申請號: 202210104006.8
• 申請日: 2022-01-28
• 公開（公告）號: CN114350774A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 康力;孫文婷;趙玉蘭
• 申請（專利權）人: 賽納生物科技(北京)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京嘉途睿知識產權代理事務所(普通合伙) 11793
• 代理人: 李鵬

本發明公開了一種芯片表面固相引物剪切效率的檢測方法：(1)將與固載在芯片上的引物互補的模板雜交到芯片上；所述引物上含有可被剪切的位點；所述模板在引物的3’端延伸出n nt；(2)芯片表面進行熒光發生測序，使每條引物上只延伸一個堿基，得到平均熒光增值int1；(3)用剪切液處理芯片，解旋；(4)芯片再次與所述模板雜交，進行熒光發生測序，加入的底物中含有A、C、G、T四種堿基，得到平均熒光增值int2；(5)計算得到剪切效率。本發明采用在芯片表面進行熒光發生測序的方法，達到了在芯片表面原位檢測固相引物剪切效率的目的。本發明的方法可以推廣應用于各種固相表面的引物剪切效率測定。

技術領域

本發明涉及一種芯片表面固相引物剪切效率的檢測方法，屬于基因測序技術領域。

背景技術

芯片固相引物剪切是在芯片上進行擴增時的常用步驟，以Illumina公司橋式擴增為代表的各種擴增技術都會使用該反應，其主要作用是將固相表面擴增出的雙鏈DNA剪切為單鏈，以供后續雜交引物進行測序反應。如果不進行剪切步驟，固相雙鏈DNA無法正常雜交測序引物進行測序反應，因此這一步驟是擴增環節中極為重要的一步。目前，剪切效率的驗證基本都是通過單獨在液相中驗證酶活或結合下游的測序質量進行；或雜交熒光探針檢測固相引物密度，但這一方法的檢測精度很低?，F有技術中并沒有精確地對芯片表面固相引物剪切效率進行直接檢測的方法。

發明內容

針對上述現有技術，本發明提供了一種芯片表面固相引物剪切效率的檢測方法，用以解決各種固相擴增過程中引物剪切效率無法在芯片上直接精確檢測的問題。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種芯片表面固相引物剪切效率的檢測方法，包括以下步驟：

(1)將與固載在芯片上的引物互補的模板雜交到芯片上；所述引物上含有可被剪切的位點；所述模板在引物的3’端延伸出n nt，以供引物延伸，所述n為大于等于2的整數(優選10～20)；

進一步的，所述可被剪切的位點為特殊修飾的堿基，比如：dU堿基，8-氧代脫氧鳥苷(8-oxo-dG)，四氫呋喃(THF)修飾的堿基；

進一步的，所述引物的長度為20～45nt；

(2)芯片表面進行熒光發生測序，使每條引物上只延伸一個堿基，得到平均熒光增值int1，即每條引物上延伸一個堿基時的單位信號；

進一步的，使每條引物上只延伸一個堿基的具體方式為：測序反應時，加入的底物中僅含一種堿基，且該堿基為引物所延伸的第一個堿基；

(3)用剪切液處理芯片，解旋；

芯片上的引物被成功剪切后，經過解旋便會從固相脫離，無法再雜交上模板，因此無法繼續在后續的測序反應過程中發生延伸并得到測序信號；

剪切過程中，剪切液作用于特殊修飾的堿基位置，并在此處將引物剪切成兩段；解旋后，固相引物自剪切處斷裂并解旋到液相中，使得擴增產物恢復為單鏈，并可以順利結合測序引物；

所述剪切液的選擇與引物上的特殊修飾的堿基相關；比如：若引物上的特殊修飾的堿基是dU堿基，則選擇USER酶混合液(主要成分為尿嘧啶DNA糖基化酶和核酸內切酶Ⅷ)為剪切液；若引物上的特殊修飾的堿基是8-氧代脫氧鳥苷，則選擇含有Fpg的酶溶液為剪切液；若引物上的特殊修飾的堿基是四氫呋喃修飾的堿基，則選擇含有EndonucleaseⅣ(Nfo)的酶溶液為剪切液；對于某些特殊修飾的固相引物，可以選擇高碘酸鈉等試劑作為剪切液；

(4)上述剪切反應處理后的芯片，再次與所述模板雜交，進行熒光發生測序，加入的底物中含有A、C、G、T四種堿基，這樣未被剪切的引物會將剩余的n-1個堿基全部延伸完，得到平均熒光增值int2；

(5)剪切效率由以下公式計算得到：