[發(fā)明專(zhuān)利]一種馬爾尼菲籃狀菌甘露聚糖蛋白及其在制備馬爾尼菲籃狀菌抗體檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210090101.7
• 申請(qǐng)日: 2022-01-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114106118B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊光;彭潔;嚴(yán)俊;盛長(zhǎng)忠;粟艷;周澤奇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 丹娜（天津）生物科技股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/385
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/385;C07K1/22;C12N15/70;C12N15/31
• 代理公司: 天津合正知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12229
• 代理人: 王雨杰

本發(fā)明創(chuàng)造提供了一種馬爾尼菲籃狀菌甘露聚糖蛋白及其在制備馬爾尼菲籃狀菌抗體檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，所述甘露聚糖蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.No.1所示。本發(fā)明的甘露聚糖蛋白可以與馬爾尼菲籃狀菌抗體結(jié)合，具有良好的敏感性和特異性，敏感性達(dá)到85.1%，特異性達(dá)到100%。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明創(chuàng)造屬于馬爾尼菲籃狀菌檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種馬爾尼菲籃狀菌甘露聚糖蛋白及其在制備馬爾尼菲籃狀菌抗體檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

馬爾尼菲籃狀菌（Talaromyces marneffei）原名馬爾尼菲青霉菌（Penicillium marneffei）是迄今所發(fā)現(xiàn)的惟一能使人類(lèi)致病的雙相青霉菌，感染人或動(dòng)物時(shí)以酵母相存在于宿主體內(nèi)。在30℃時(shí)馬爾尼菲籃狀菌呈現(xiàn)為菌絲型態(tài)，而在37℃時(shí)則為酵母型態(tài)。前者在培養(yǎng)基中可形成紅色素，后者沒(méi)有。只有酵母型態(tài)才有致病性。此外，馬爾尼菲籃狀菌在兩者之間轉(zhuǎn)換的時(shí)間長(zhǎng)短不一，從酵母型態(tài)變?yōu)榫z型態(tài)較容易，只需要1～2天即長(zhǎng)出帚狀枝并產(chǎn)生紅色色素；而后者轉(zhuǎn)變?yōu)榍罢咝枰?個(gè)星期以上，會(huì)經(jīng)過(guò)一個(gè)短棒狀或畸形的過(guò)渡期，所以無(wú)法在早期就判斷是單型態(tài)籃狀菌。

馬爾尼菲籃狀菌病(TM)主要是侵犯單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，即肺、肝、腸淋巴組織、淋巴結(jié)、脾、骨髓、腎和扁桃體等，以肺及肝最為嚴(yán)重。馬爾尼菲籃狀菌能侵入機(jī)體，在營(yíng)養(yǎng)豐富的深部組織器官生長(zhǎng)繁殖，造成致命損傷。馬爾尼菲籃狀菌感染者尤以中國(guó)南部和東南亞地區(qū)居多。馬爾尼菲籃狀菌病可發(fā)生于健康者，但更多見(jiàn)于免疫缺陷或免疫功能抑制者，是艾滋病(AIDS)患者常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染和致死原因之一。越南研究結(jié)果顯示馬爾尼菲籃狀菌病在AIDS患者的機(jī)會(huì)性感染中居第3位。近年來(lái)，隨著艾滋病的流行范圍擴(kuò)大以及糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等大量使用，馬爾尼菲籃狀菌病的發(fā)病率逐年上升。

馬爾尼菲籃狀菌病患者常規(guī)生化檢查結(jié)果異常的主要包括：血紅蛋白、血小板、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、球蛋白、免疫功能等。上述檢查結(jié)果無(wú)明顯特異性，需與患者的臨床表現(xiàn)相結(jié)合，在疑似馬爾尼菲籃狀菌病或抗結(jié)核治療無(wú)效時(shí)，才會(huì)對(duì)病原體進(jìn)行檢查。目前確診馬爾尼菲籃狀菌病主要依靠病原菌培養(yǎng)，由于培養(yǎng)時(shí)間一般需要7~10d，因此早期診斷非常困難，容易錯(cuò)過(guò)患者治療最佳時(shí)間，導(dǎo)致病情惡化等不良后果。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道血清半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)抗原可作為檢測(cè)馬爾尼菲籃狀菌的標(biāo)志物，患有馬爾尼菲籃狀菌病的艾滋病患者血清GM檢測(cè)OD值顯著高于正常值，可用于馬爾尼菲籃狀菌的早期診斷。但是由于曲霉菌屬和青霉菌屬的細(xì)胞壁中都含有GM，因此GM用于檢測(cè)馬爾尼菲籃狀菌時(shí)會(huì)與青霉菌屬存在交叉反應(yīng)，特異性較低。

甘露聚糖蛋白(Mp1p)是馬爾尼菲籃狀菌細(xì)胞壁特異性的多糖抗原，是馬爾尼菲籃狀菌感染巨噬細(xì)胞的重要致病因子。國(guó)內(nèi)艾滋病合并馬爾尼菲籃狀菌病臨床診療的專(zhuān)家共識(shí)指出，甘露聚糖蛋白可應(yīng)用于馬爾尼菲籃狀菌感染診斷，通過(guò)間接免疫熒光法和酶聯(lián)免疫法檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的抗體，可成功檢測(cè)馬爾尼菲籃狀菌感染，且與其他病原菌無(wú)交叉反應(yīng)。

半乳甘露聚糖是一種多糖抗原，主要存在于曲霉菌屬和青霉菌屬細(xì)胞壁，是檢測(cè)侵襲性曲霉感染的重要標(biāo)志物。侵襲性曲霉感染人體后，會(huì)釋放半乳甘露聚糖，馬爾尼菲籃狀菌在人體內(nèi)生產(chǎn)時(shí)同樣也會(huì)釋放半乳甘露聚糖。有文獻(xiàn)報(bào)道半乳甘露聚糖可用于馬爾尼菲籃狀菌病的早期診斷，但是基于兩種菌都可產(chǎn)生半乳甘露聚糖，所以會(huì)存在假陽(yáng)或假陰，特異性較差。

為解決上述問(wèn)題，有文獻(xiàn)報(bào)道從馬爾尼菲籃狀菌液體培養(yǎng)基中提取相關(guān)蛋白抗原，培養(yǎng)液經(jīng)鹽析和弱酸沉淀法純化、再經(jīng)透析和除菌，最終制備成馬爾尼菲籃狀菌純蛋白衍生物。此種方法受培養(yǎng)基的使用，pH和溫度的控制等影響較大，只能小劑量的提取蛋白、效率低、重復(fù)性差，且提取物會(huì)含有多種蛋白，不具備高特異性標(biāo)志物條件，因此不適合應(yīng)用于血清學(xué)免疫診斷馬爾尼菲籃狀菌病。