[發明專利]適于低豐度樣本檢測的RPA擴增方法

在審

• 申請號: 202210062348.8
• 申請日: 2022-01-19
• 公開（公告）號: CN114540465A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 秦愛平;熊衍文;邵祝君
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發明提供一種適于低豐度樣本檢測的RPA擴增方法，包括兩輪RPA擴增反應：第一輪反應以提取的樣本DNA為模板，利用引物RPA?F和RPA?R進行基礎RPA擴增；第二輪反應以第一輪反應產物為模板，利用引物RPA?F和RPA?R?biotin以及探針進行RPA?nfo擴增(方案eRPA1.1)；進一步地，在進行第一輪反應之前，先用去抑制劑處理提取的樣本DNA，再進行RPA擴增(方案eRPA2.1)。不同于傳統巢式RPA需要2對引物，本發明eRPA技術只需設計1對引物，利用方案eRPA1.1、eRPA2.1極大提高了RPA對現場、臨床樣本中靶核酸的檢出率。使RPA檢測技術從實驗室轉化于實際成為可能。

技術領域

本發明涉及核酸檢測技術領域，具體地說，涉及一種適于低豐度樣本檢測的RPA擴增方法。

背景技術

重組酶-聚合酶-擴增技術(Recombinase ploymerase Amplification,RPA)是近年來發展起來的一種新的DNA恒溫擴增技術，是一種有望替代PCR、最有潛力發展成為POCT(Point-of-care testing)的分子檢測手段。RPA技術靈敏度高，特異性好，不需要特殊設備，可在低溫(30℃-45℃)下甚至人體溫度下進行擴增，30分鐘內就可以進行結果判定，對于醫學、食品、獸醫等領域細菌、病毒、寄生蟲的快速檢測具有廣泛應用前景。利用重組酶-聚合酶-擴增目的基因片段，之后根據實驗設計用不同手段檢測擴增產物。包括基礎RPA(Basic RPA，用瓊脂糖電泳或SYBR green觀察擴增結果)；RPA-nfo(結合測流層析試紙條法RPA)；RPA-exo(測定熒光法RPA)。RPA在實驗室純靶基因DNA作為模板條件下，靈敏度可與熒光定量PCR(TaqMan PCR)相當(達fg級)。但RPA在現場標本和臨床樣本如血樣本的檢測中，靈敏度顯著降低(到皮克pg)級。原因之一是樣本中靶基因豐度低和宿主細胞中可能存在的RPA抑制物影響所致。同巢式PCR相似，巢式RPA同樣能提高檢測靈敏度。其基本本原理是在靶片段上游和下游再設計一對引物進行第一步RPA(Step1)，之后進行靶基因RPA-nfo或RPA-exo擴增(Step2)；或者對巢式RPA兩對引物進行特殊修飾，一步法進行核酸的巢式擴增。另外一種策略是采用RAMP技術，它是一種結合RPA擴增和LAMP(環式介導的恒溫擴增，Loop-Mediated Isothermal Amplification)的兩階段恒溫擴增方案。

RPA檢測方法具備了進行床邊檢測(POCT)的潛能。但不同于實驗室制備的模擬樣品，臨床標本中優勢核酸是宿主DNA。而且提取的實際樣本DNA中有抑制RPA的物質存在。所以RPA摻標血樣的最低檢測量LOD_blood(ca.＝20pg)比LOD_PBS(ca.＝200fg)降低100倍以上。如何消除實際樣本中的抑制物對RPA的影響是RPA檢測方法現場/臨床廣泛應用的瓶頸之一。

現場/臨床樣本如食品飲料中污染的微生物、非菌血期細菌感染血樣等，其目標DNA的豐度通常非常低，對于高靈敏度熒光定量PCR擴增循環數(Ct)大于30小于35的陽性樣本，標準RPA-nfo檢測通常均為陰性。

因此，亟需建立一種適于低豐度樣本檢測的RPA擴增技術，以提高對現場/臨床樣本的檢出率。

發明內容

本發明的目的是提供一種適于低豐度樣本檢測的RPA擴增方法，即增強重組酶-聚合酶-擴增技術(enhanced RPA,eRPA)。

為了實現本發明目的，第一方面，本發明提供一種適于低豐度樣本檢測的RPA擴增方法(增強RPA方案之一，eRPA1.1)，包括兩輪RPA擴增反應：第一輪反應是以提取的樣本DNA為模板，利用引物RPA-F和RPA-R進行基礎RPA擴增；第二輪反應是以第一輪反應產物為模板，利用引物RPA-F和RPA-R-biotin以及探針進行RPA-nfo擴增。

其中，引物RPA-F和RPA-R是針對靶核酸設計的；