[發明專利]適于低豐度樣本檢測的RPA擴增方法

在審

• 申請號: 202210062348.8
• 申請日: 2022-01-19
• 公開（公告）號: CN114540465A
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 秦愛平;熊衍文;邵祝君
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

1.適于低豐度樣本檢測的RPA擴增方法，其特征在于，包括兩輪RPA擴增反應：第一輪反應是以提取的樣本DNA為模板，利用引物RPA-F和RPA-R進行基礎RPA擴增；第二輪反應是以第一輪反應產物為模板，利用引物RPA-F和RPA-R-biotin以及探針進行RPA-nfo擴增；

其中，引物RPA-F和RPA-R是針對靶核酸設計的；

探針位于引物RPA-F和RPA-R的擴增子內，探針5’端標記熒光基團，5’端下游30-33bp處標記核酸外切酶識別位點THF，探針3’端經磷酸化修飾。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在進行第一輪反應之前，先用去抑制劑處理提取的樣本DNA，再進行RPA擴增；

所述去抑制劑包含rCutsmart buffer和內切酶Xhol，其中rCutsmart buffer購自NEB公司；

去抑制反應體系如下：

去抑制反應條件：瞬間離心，37℃放置20-60min。

3.非診斷目的檢測立克次氏體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取待測樣本總DNA，或經去抑制劑處理后的待測樣本總DNA；

2)配制含有上、下游引物的基礎RPA反應體系，向反應體系中加入上述提取的總DNA，進行第一輪RPA擴增；

3)配制含有上、下游引物和探針的RPA-nfo反應體系，向反應體系中加入第一輪擴增產物，進行第二輪RPA擴增；

4)分析擴增產物；

其中，上游引物為：5’-AATTCACAACTTGCCATTGTCCGTCAGGTT-3’

下游引物為：5’-CTGTAACGGTCCAGGCGGTATGAATAAACA-3’

探針為：5’-FAM-CCGGATTACGCCATTCTACGTTACTACCAC[THF]AGGAGCTCTTTCTAAAG-C3Spacer-3’

所述去抑制劑包含rCutsmart buffer和內切酶Xhol，其中rCutsmart buffer購自NEB公司。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，第一輪RPA反應體系包括：

其中，基礎RPA凍干粉管包含噬菌體同源重組酶、DNA聚合酶、單鏈結合蛋白和dNTPs。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，第二輪RPA反應體系包括：

其中，RPA-nfo凍干粉管包含噬菌體同源重組酶、DNA聚合酶、單鏈結合蛋白、dNTPs及核酸外切酶。

6.根據權利要求3-5任一項所述的方法，其特征在于，RPA擴增條件為：30-45℃，15-60min。

7.非診斷目的檢測恙蟲病東方體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取待測樣本總DNA，或經去抑制劑處理后的待測樣本總DNA；

2)配制含有上、下游引物的基礎RPA反應體系，向反應體系中加入上述提取的總DNA，進行第一輪RPA擴增；

3)配制含有上、下游引物和探針的RPA-nfo反應體系，向反應體系中加入第一輪擴增產物，進行第二輪RPA擴增；

4)分析擴增產物；

其中，上游引物為：5’-GTATCAACAAGAAGTGTTCTTAGGTTCTGG-3’

下游引物為：5’-CCTTCAAGATTAAACATCGGTCCACGAAAG-3’

探針為：5’-Digoxin-CATGATGGTTCAGAACTGATAGCAGAATTA[THF]TTGGCAGTGACAATA-C3Spacer-3’

所述去抑制劑包含rCutsmart buffer和內切酶Xhol，其中rCutsmart buffer購自NEB公司。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，第一輪RPA反應體系包括：

其中，基礎RPA凍干粉管包含噬菌體同源重組酶、DNA聚合酶、單鏈結合蛋白和dNTPs。