[發明專利]一種基于空氣中DNA的植物病菌檢測方法

在審

• 申請號: 202210054054.0
• 申請日: 2022-01-18
• 公開（公告）號: CN114350844A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 孫曉勇;趙弘巍;張藝邁;李晗
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

本發明提供了一種基于空氣中DNA的植物病菌檢測方法。包括：在環境中收集病菌的氣體樣品；通過過濾排除空氣中懸浮孢子的影響，提取空氣中的DNA；使用病菌特異性引物檢測空氣DNA中植物病菌的信號，對樣本進行PCR擴增；建立基于氣象因子的病菌DNA含量檢測模型。

技術領域

本發明屬于植物病菌檢測領域，尤其涉及基于空氣中DNA的水稻稻瘟病檢測方法。

背景技術

公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

目前檢測植物病菌的的方法主要有4種，即基于光譜技術進行特征提取，建立植物病菌檢測模型進行檢測；基于機器學習建立檢測模型檢測植物病害；捕捉空氣中的孢子并對病害孢子進行識別；根據與病菌發生有關的氣象因子建立模型進行預測。環境DNA是推動生物監測與生態學研究發展的工具之一，被用于生物監測、物種占域研究、瀕危物種與入侵物種的檢測等研究，尤其是在水生生態系統中。已有研究證明，環境DNA可以從空氣中收集。根據以上研究基礎，發明人提出了一種新的思路，即通過提取空氣中的DNA來檢測其中的植物病菌的方法。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供一種基于空氣中DNA的植物病菌檢測方法，旨在提取空氣中的DNA并對其進行分析，根據稻田附近的環境信息如風速、高度等進行建模，得出空氣DNA中植物病菌DNA的含量，幫助提前植物病菌的發現時間，提高防治效率。

本發明提供的一種基于空氣中DNA的植物病菌檢測方法，主要實現樣品的采集與數據的分析。

一種基于空氣中DNA的植物病菌檢測方法，主要包括以下步驟：

(1)在環境中采集樣本；(2)在采集的樣本中提取空氣中的DNA；(3)使用特異性引物檢測植物病菌DNA并進行PCR擴增；(4)記錄采樣的高度，采樣時的風速，建立一個植物病菌DNA含量檢測模型。

進一步的，植物病菌包括稻瘟病菌、玉米小斑病菌、水稻紋枯病菌等。優選的，所述植物病菌為稻瘟病菌。

進一步的，步驟(2)中包括過濾氣體樣品、CTAB法提取DNA；

所述過濾氣體樣品具體步驟為：將壓力過濾器指向樣本，收集、過濾指定流速和時間下的稻瘟病菌的氣體樣品；

所述壓力過濾器包括抽真空干燥器、蠕動泵、細菌過濾器、捕獲過濾器，抽真空過濾干燥器提供了放置氣體樣品的空間，通過蠕動泵將抽真空過濾干燥器中的氣體樣品輸送到細菌過濾器，細菌過濾器將過濾掉懸浮孢子，隨后捕獲過濾器將捕獲富集空氣中的DNA。

壓力過濾器中，在0.45μm的濾芯前串聯一個0.2μm的細菌過濾器。

所述CTAB法提取DNA具體為：

(a1)用注射器注射3ml的CTAB到壓力過濾器中，吸打混勻；

(a2)將步驟(a1)得到的CTAB Buffer平均分裝進1.5ml離心管中，每管500ul左右；

(a3)離心管放入65℃水浴鍋加熱15min；

(a4)加入500ul苯酚:氯仿:異丙醇(24:25:1)，震蕩混合均勻，靜止5min；

(a5)以13000轉/分鐘的速度離心10分鐘；

(a6)為增加提取的DNA含量，吸取步驟(a5)中離心后的上清重復步驟(a4)和(a5)；

(a7)在新的離心管中加入500ul異丙醇，加入步驟(a6)中的上清，放入-70℃溫度下超過1h；

(a8)以13000轉/分鐘的速度離心步驟(a7)中的混合液15min。