[發(fā)明專利]調控CapBCA單體表達水平的菌株及在聚谷氨酸生產的應用

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• 申請日: 2022-01-11
• 公開（公告）號: CN114369561A
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發(fā)明（設計）人: 徐國強;王籍閱;劉燕;張曉娟;張曉梅;史勁松;許正宏
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12P13/02;C12R1/15
• 代理公司: 無錫承果知識產權代理有限公司 32373
• 代理人: 肖昂

本發(fā)明公開了一種調控CapBCA單體表達水平的菌株及在聚谷氨酸生產中的應用，本發(fā)明將天然生產菌地衣芽孢桿菌的γ?聚谷氨酸合成酶的基因簇capBCA克隆至一株高產谷氨酸的谷氨酸棒桿菌F343中進行外源表達，在此基礎上，利用不同數(shù)量的lacO調控合成酶基因簇各基因的表達水平，獲得的重組菌株所生產的γ?PGA產量為3.63～5.84g/L，產率為0.15～0.27g/L/OD₆₀₀。還發(fā)現(xiàn)單獨提高CapB和CapC的表達強度，及適度表達CapA均有利于γ?PGA的合成，而且CapC對于γ?PGA的合成發(fā)揮著至關重要的作用，其表達水平對γ?PGA產量的影響貢獻度可達68.24％。結果有助于深入了解γ?PGA合成酶單體的功能，以及對γ?PGA合成的影響規(guī)律。

技術領域

本發(fā)明涉及合成生物學和發(fā)酵工程領域，具體是調控CapBCA單體表達水平的菌株及在聚谷氨酸生產的應用，分別調控CapB，CapC，CapA單體的表達水平，構建了生產γ-聚谷氨酸能力不同的谷氨酸棒桿菌。

背景技術

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一種由L-谷氨酸和D-谷氨酸單體聚合成的生物聚合物，具有水溶性高、良好的生物降解特性、較強的增稠能力等性質，對金屬離子具有優(yōu)異的吸收性和結合能力。近年來，γ-PGA廣泛應用于食品、化妝品、生物醫(yī)學、環(huán)境保護等領域。

目前，微生物發(fā)酵是生產商業(yè)γ-PGA的主要方法，因為它具有原料廉價，環(huán)境污染少，天然產物純度高等優(yōu)點。主要的γ-PGA生產菌株是芽孢桿菌屬，根據生產過程中，是否需要額外添加谷氨酸作為前體，γ-PGA生產菌株可以分為兩種類型，即谷氨酸依賴型菌株和谷氨酸非依賴型菌株。有學者先后選擇E.coli和C.glutamicum為底盤細胞，通過異源表達γ-PGA合成酶，成功實現(xiàn)了γ-PGA的合成。

γ-PGA合成酶CapBCA(同源物是PgsBCA)由capB，capC和capA基因編碼，負責催化谷氨酸合成γ-PGA。capB，capC和capA在γ-PGA合成過程中的重要性尚不清晰，限制了γ-PGA合成的進一步調控。目前的研究主要是通過提高γ-PGA合成酶的表達水平提高γ-PGA的產量。課題組前期在谷氨酸棒桿菌中異源表達γ-PGA合成酶，發(fā)現(xiàn)僅誘導型表達可以積累γ-PGA，而組成型表達菌株中pgsBCA基因的表達強度不可調控導致γ-PGA未能合成。因此本研究嘗試通過調控capB，capC和capA單體蛋白的表達強度，得到一種capB，capC和capA適度表達的組合，以實現(xiàn)γ-PGA的進一步積累。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是在谷氨酸棒桿菌中調控聚合酶基因capB,capC,capA，研究γ-PGA合成酶單體蛋白對谷氨酸棒桿菌合成γ-聚谷氨酸的影響。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種調控CapBCA單體表達水平的方法，以谷氨酸棒桿菌C.glutamicum為感受態(tài)細胞，利用操縱子工程單獨調控γ-PGA合成酶基因簇capBCA的capB、capC、capA基因中任意一個的表達水平，并進行串聯(lián)表達，構建單獨調控capBCA單體表達水平的基因工程菌；

所述γ-PGA合成酶基因簇capBCA選自地衣芽孢桿菌；

所述操縱子工程為不同數(shù)量的lacO調控，包括高強度1×[lacO]、中強度2×[lacO]和低強度4×[lacO]其中任意一個。

本發(fā)明采用的方法是對γ-聚谷氨酸合成酶基因簇capBCA表達水平單獨調控并串聯(lián)，具體方法是：先提取地衣芽孢桿菌基因組，通過PCR分別擴增出γ-聚谷氨酸合成酶基因capB、capC、capA，利用不同數(shù)量的lacO，單獨調控γ-PGA合成酶基因capB、capC、capA中任意一個的表達水平，再通過同尾酶技術得到串聯(lián)表達重組質粒，轉化到感受態(tài)細胞C.glutamicum中，最終構建了單獨調控γ-PGA合成酶基因簇簇capBCA單體表達水平的重組菌株。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述capB、capC、capA的序列分別如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示。