[發(fā)明專利]一種鑒別勃氏牡丹的引物、試劑、鑒別方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210014166.3
• 申請日: 2022-01-06
• 公開（公告）號: CN114231603B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李井干;吳晶;劉曉宇;伏建國;余本淵;楊曉軍
• 申請（專利權(quán)）人: 南京海關(guān)動植物與食品檢測中心
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京太兆天元知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11108
• 代理人: 張洪年

本發(fā)明涉及鑒別領(lǐng)域，特別是涉及瀕危野生動植物的鑒別領(lǐng)域，更為具體的說是涉及一種鑒別勃氏牡丹的引物、試劑、鑒別方法及試劑盒，通過對巖牡丹屬植物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，發(fā)現(xiàn)勃氏牡丹與其他的巖牡丹屬植物相比較，在PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)功能基因序列上存在11個堿基的突變位點。進(jìn)一步篩選其中的9個堿基的突變位點進(jìn)行設(shè)計，從而獲得勃氏牡丹的實時熒光定量PCR的特異性引物和熒光探針，用于研究勃氏牡丹的分子鑒別方法，并檢測該方法的靈敏度，為瀕危物種的鑒別提供新的技術(shù)路線。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及鑒別領(lǐng)域，特別是涉及瀕危野生動植物的鑒別領(lǐng)域，更為具體的說是涉及一種鑒別勃氏牡丹的引物、試劑、鑒別方法及試劑盒。

背景技術(shù)

勃氏牡丹Ariocarpus?bravoanus屬仙人掌科巖牡丹屬，原產(chǎn)墨西哥。勃氏牡丹在世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)瀕危物種紅色名錄中被評為“瀕危”級別，同時被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(簡稱為《公約》)。

對于勃氏牡丹的鑒別目前仍以形態(tài)學(xué)為主，而生態(tài)學(xué)鑒別對于專業(yè)鑒別人員的依賴性很重，這就導(dǎo)致各海關(guān)口岸無法在鑒別過程中需要配備大量的形態(tài)鑒別專家。人才短缺，以及形態(tài)學(xué)鑒別中依賴人工觀察，對于與勃氏牡丹形態(tài)上較為相似的龜甲牡丹、龍舌蘭牡丹的干擾，使得勃氏牡丹的鑒別成為海關(guān)口岸查驗工作的亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何突破勃氏牡丹鑒別中對形態(tài)學(xué)專家的依賴性，提供一種新的鑒別方法，從而緩解人才壓力，同時避免人工鑒別中由于人為因素造成的誤判。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種鑒別勃氏牡丹的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，上游引物為5′-CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA-3′?(SEQ?ID?NO：1)，下游引物為5′-GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT-3′(SEQ?ID?NO：2)。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明中還進(jìn)一步公開了一種鑒別勃氏牡丹的試劑，所述的試劑中包括有PCR引物及熒光探針，其中PCR引物包括上游引物和下游引物，上游引物為5′-CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA-3′(SEQ?ID?NO：1)，下游引物為5′?-GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT-3′(SEQ?ID?NO：2)，探針序列為5′TGTATCCTATTAGGCTATTACCTGACACC-3′(SEQ?ID?NO：3)。

優(yōu)選地，所述熒光探針5′端含有FAM熒光報告基團(tuán)，3′端含有不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)BHQ1。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明中還公開了鑒別勃氏牡丹的方法，包括以下步驟：

S1：提取樣品植物DNA；

S2：以前述上游引物、下游引物及探針形成的PCR反應(yīng)體系對S1中提取的樣品植物DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；

S3：如果有典型的擴(kuò)增曲線，表明該待測的樣品植物為勃氏牡丹；如果沒有典型的擴(kuò)增曲線，說明該待測的樣品植物不為勃氏牡丹。

優(yōu)選地，在本發(fā)明中還公開了前述兩個擴(kuò)增反應(yīng)S2中的退火溫度為60℃。

進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明中還公開了前述兩個擴(kuò)增反應(yīng)S2中PCR反應(yīng)參數(shù)為?94℃，15s；60℃，1min；40個循環(huán)。

同時，在本發(fā)明中還公開了鑒別勃氏牡丹的試劑盒，所述試劑盒中包括上游引物5′-CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA-3′(SEQ?ID?NO：1)，下游引物5′-?GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT-3′(SEQ?ID?NO：2)，熒光探針5′-FAM-TGTATCCTATTAGGCTATTACCTGACACC-BHQ1-3′。