[發(fā)明專利]一種基于微量樣本的高通量識別血液中痕量有機污染物的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210011503.3
• 申請日: 2022-01-06
• 公開（公告）號: CN114354808A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韋斯;李萊輝;于南洋;王學(xué)兵;于紅霞
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/86
• 代理公司: 江蘇瑞途律師事務(wù)所 32346
• 代理人: 陳彬

1.一種基于微量樣本的高通量識別血液中痕量有機污染物的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

(1)樣品前處理：在96孔板中加入30～100μL血液樣品，按照血液樣品：萃取劑的體積：質(zhì)量比為1：(0.54±0.2)的比例加入萃取劑，并加入固定體積的乙腈，渦旋混勻后離心取上清液，氮吹濃縮后使用100μL的乙腈復(fù)溶；

(2)上機測定：通過UPLC-Q-Exactive液質(zhì)聯(lián)用對前處理后的樣品進行全掃描分析檢測；

(3)樣品峰提取：將步驟(2)中儀器分析得到的有機污染物譜圖結(jié)果保存為RAW文件，使用格式轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)為ABF文件后導(dǎo)入MSDIAL ver 4.48軟件中提取樣品峰；

(4)污染物識別：根據(jù)步驟(3)中提取的樣品峰，通過庫匹配污染物靶向識別，和/或無法靶向識別的污染物利用分子網(wǎng)絡(luò)工具進行識別。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于微量樣本的高通量識別血液中痕量有機污染物的方法，其特征在于，所述萃取劑為硫酸鎂-氯化鈉混合物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于微量樣本的高通量識別血液中痕量有機污染物的方法，其特征在于，所述固定體積的乙腈為300～400μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種基于微量樣本的高通量識別血液中痕量有機污染物的方法，其特征在于，所述樣品前處理還包括過程空白，用等體積的Fisher水代替血液樣品重復(fù)樣品前處理流程。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的一種基于微量樣本的高通量識別血液中痕量有機污染物的方法，其特征在于，步驟(2)中UPLC-Q-Exactive液質(zhì)聯(lián)用條件為：

色譜儀：Ultimate 3000超高效液相色譜(Thermo fisher，美國)；

色譜柱：C18柱(2.1mm×50mm，2.5μm，)；

柱溫：40℃；

流速：0.3mL/min；

正離子模式流動相：0.1％甲酸-水溶液(A相)，甲醇(B相)；

負(fù)離子模式流動相：2mM乙酸銨水溶液(A相)，甲醇(B相)；

梯度洗脫表：

質(zhì)譜儀：Q-Exactive靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜；

全掃描模式：數(shù)據(jù)依賴掃描模式；

離子源：正負(fù)電噴霧電離源；

全掃描質(zhì)量范圍：一級80-1000Da，二級50-800Da；

碰撞能：±35eV；

碰撞能擴散：15eV；

離子源溫度：412.5℃。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種基于微量樣本的高通量識別血液中痕量有機污染物的方法，其特征在于，步驟(3)中所述樣品峰提取的參數(shù)設(shè)置為：

提峰質(zhì)量范圍：80-1000Da；

提峰質(zhì)量誤差：0.01Da；

提峰信噪比：S:N3；

提峰保留時間：1-50min。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種基于微量樣本的高通量識別血液中痕量有機污染物的方法，其特征在于，步驟(3)中所述樣品峰提取還包括對齊校正，樣品峰對齊校正的參數(shù)設(shè)置為：

對齊保留時間誤差：0.1min；

對齊質(zhì)量誤差：0.015Da。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種基于微量樣本的高通量識別血液中痕量有機污染物的方法，其特征在于，步驟(3)中所述樣品峰提取還包括過濾，樣品峰過濾的參數(shù)設(shè)置為：

依據(jù)3σ原則，保留大于空白樣品峰面積average+3std的樣品峰面積。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種基于微量樣本的高通量識別血液中痕量有機污染物的方法，其特征在于，步驟(4)中所述庫匹配污染物靶向識別包括在MSDIAL軟件中分別加載正負(fù)離子模式的MSP數(shù)據(jù)庫文件，與樣品峰列表進行比對與匹配，匹配標(biāo)簽包括精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、同位素分布和二級譜圖信息；和/或所述利用分子網(wǎng)絡(luò)工具進行識別包括基于GNPS，根據(jù)相似性對樣本的質(zhì)譜碎片進行聚類并注釋。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種基于微量樣本的高通量識別血液中痕量有機污染物的方法，其特征在于，

所述上述MSDIAL中設(shè)置的匹配參數(shù)為：

質(zhì)量誤差：一級0.002Da，二級0.01Da；

保留時間容許誤差：2min；

打分值閾值：80分；

所述匹配特征離子的參數(shù)設(shè)置為：

質(zhì)量誤差：0.005Da；

保留時間容許誤差：0.1min；

和/或所述基于GNPS平臺構(gòu)建分子網(wǎng)絡(luò)的參數(shù)設(shè)置為：

Min Paris Cos:0.7；

Network Topk:10；

Maximum Connected Component Size:100；

Minimum Matched Fragment Ions:2；

Minimum Cluster Size:1；

使用的GNPS數(shù)據(jù)庫有MONA、BERKELEY-LAB、BILELIB19、CASMI、SCIEX、NIH-CLINICALCOLLECTION1、NIH-CLINICALCOLLECTION2、SELLECKCHEM-FDA-PART1、SELLECKCHEM-FDA-PART2、NIH-NATURALPRODUCTSLIBRARY、NIST14-MATCHES、IOBA-NHC、PNNL-LIPIDS、IQAMDB、LDB_POSITIVE、LDB_POSITIVE、MMV_POSITIVE、NIH-SMALLMOLECULEPHARMACOLOGICALLYACTIVE。

庫搜索參數(shù)設(shè)置為：

Library Search Min Matched:2；

Score Threshold:0.7；

Maximum Analog Search Mass Difference:100。