[發明專利]一種鞭毛素突變體及其在制備非洲豬瘟抗原融合蛋白中的應用

有效

• 申請號: 202210005159.7
• 申請日: 2022-01-05
• 公開（公告）號: CN114292314B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 金梅林;鄒忠;左文峰;康超;楊于;尚霄敏;黎晶晶;楊麗;孫小美;何興林
• 申請（專利權）人: 武漢科前生物股份有限公司;華中農業大學
• 主分類號: C07K14/255
• 分類號: C07K14/255;C07K19/00;C12N15/70;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明屬于生物技術領域，公開了一種鞭毛素突變體及其在制備非洲豬瘟抗原融合蛋白中的應用。所述的鞭毛素突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO.4所示。本發明提供的鞭毛素截短突變體Fm能夠高效上清表達，每升搖瓶培養及純化后的蛋白產率可以達到40mg，易于放大及規模化生產，可以提高鞭毛素蛋白的廣泛應用。將其與非洲豬瘟抗原蛋白融合后，在保持鞭毛素佐劑活性的同時，提高重組抗原的可溶性及表達水平，大大降低了表達及純化工藝成本。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種鞭毛素突變體及其在制備非洲豬瘟抗原融合蛋白中的應用。

背景技術

通過鞭毛素蛋白與目的蛋白混合或融合后免疫，可以提高機體對抗原的免疫應答，其中鞭毛素融合或偶聯抗原免疫效果更為顯著【1】【2】，以鞭毛素為佐劑的核酸疫苗僅在實驗室階段研究，雖然不用經過蛋白純化工藝，但是核酸疫苗本身面臨著不可預知的安全風險和臨床監管；目前很多致病菌的鞭毛素可能具有潛在的危險性和毒性，免疫動物后產生大量針對自身的抗體，導致可能的耐受性及炎癥反應，這主要源于鞭毛素可變區的高免疫原性。沙門氏同種屬的鞭毛素蛋白的氨基及羧基末端比較保守，從結構上可以分為保守的D0，D1,可變區D2和D3區；其中鞭毛素蛋白抗原性很強的區域位于D2和D3區，根據文獻報道，外源抗原通常可以與鞭毛素羧基端連接或插入高可變區(I型鞭毛素174-400位或201-368位)，均保留了鞭毛素TLR5信號通路活性【3、4】。保守D0結構域由N端和C端兩組α螺旋構成，C末端6個氨基酸VLSLLR形成疏水基序Motif，位于鞭毛素內核，亞基間的強疏水相互作用是參與鞭毛素組裝的關鍵驅動力【5、6】。

近年來非洲豬瘟在國內外集約化養豬場的感染率和發病率日益提高，給養殖場帶來巨大的經濟損失。非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(Africanswine fever virus，ASFV)引起的以高熱、皮膚發紺、淋巴及內臟器官嚴重出血為特征的急性、接觸性傳染病，一旦暴發，死亡率接近90-100％。家豬和野豬是該病毒的自然宿主，感染后可終身帶毒。ASFV是一種單股、兩端共價連接的雙鏈DNA病毒，具有二十面體結構，基因組全長約170kb～190kb，主要由4層組成：中央核仁、核衣殼、內層囊膜和二十面體的病毒衣殼，胞外病毒粒子，核衣殼具有雙層囊膜。

研究表明，非洲豬瘟p54、p30等結構蛋白在病毒入侵，衣殼組裝上起到重要作用【7、8】以這些蛋白為靶標的核酸疫苗及活載體疫苗均能一定程度上抑制非洲豬瘟在肺泡巨噬細胞(PAM)上的復制和增殖，降低帶毒量，延緩病情的發作。非洲豬瘟病毒的傳播途徑主要為糞口傳播，在唾液和扁桃體的分離率很高。因此，提高粘膜免疫對于非洲豬瘟的防控具有積極意義。

因此本發明對腸道沙門氏菌鞭毛素(WP_050188722)進行設計突變，與非洲豬瘟抗原融合表達，以期提高免疫豬群對靶抗原的黏膜免疫效果。

發明內容

本發明的目的是提供一種鞭毛素突變體，所述的鞭毛素突變體，該突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO.4所示。該突變體在降低鞭毛素抗原區免疫引起的副反應的同時，能夠維持鞭毛素的佐劑活性。

本發明的另一個目的在于提供鞭毛素突變體在制備非洲豬瘟抗原融合蛋白中的應用。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：

申請人以腸道沙門氏菌鞭毛素(WP_050188722)為來源，以蛋白結構數據庫5A3X主題骨架為模板，通過分子動力學模擬設計，保留了部分可變區的連接區，以最短的Linker序列GSGPGG替換了鞭毛素抗原可變區178～320位氨基酸(圖1)，該鞭毛素突變體的預測自由能最?。煌瑫r去除了C末端促進鞭毛素亞基組裝的6個氨基酸VLSLLR，以防止標簽序列的包裹，提高鞭毛素蛋白的純化效率；整個突變體在降低鞭毛素抗原區免疫引起的副反應的同時，能夠維持鞭毛素的佐劑活性。獲得的突變體Fm的氨基酸序列為SEQ ID NO.4所示，編碼該突變體的核苷酸為SEQ ID NO.3所示。