[發明專利]一種使用耐熱重組HNH型核酸內切酶切割DNA的方法

在審

• 申請號: 201610060896.1
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105567766A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 張立奎;黃彥超;楊立翔;徐家俊
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 戴朝榮

1.一種使用耐熱重組HNH型核酸內切酶切割DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)利用具有如下核苷酸序列的擴增引物，以深海嗜熱噬菌體GVE2基因組為模板進行PCR 擴增：

正向引物為：5'-GGAATTCCATATGCCAAGCAAACCACTGCGACC-3'，

反向引物為：5'-CCGCTCGAGCCCATACCGTCGCTTATCTTCCG-3'；

2)對步驟1)中得到的PCR擴增產物和pET-30a載體進行NdeI和XhoI雙酶切反應；

3)回收并純化步驟2)中所得的酶切后的PCR產物和pET-30a載體片段后，進行酶基因 與載體的連接反應；

4)將步驟3)中所得的連接產物轉化到感受態細胞中，隨后涂布在含有卡那霉素的LB 平板進行培養后挑取克隆，并提取質粒進行測序驗證；

5)將步驟4)中獲得的基因序列正確的克隆質粒轉化到感受態細胞中進行誘導表達；

6)從步驟5)中所獲得的細胞中提取并純化該耐熱重組核酸內切酶；

7)使用步驟6)中獲得的GVE2HNH型核酸內切酶切割DNA：切割反應溫度大于60℃，切 割反應pH值大于5.5。

2.如權利要求1所述的一種使用耐熱重組HNH型核酸內切酶切割DNA的方法，其特征在于， 步驟7)中所述切割反應溫度為60-70℃。

3.如權利要求1所述的一種使用耐熱重組HNH型核酸內切酶切割DNA的方法，其特征在于， 步驟7)中所述切割反應pH值為大于7.5。

4.如權利要求1所述的一種使用耐熱重組HNH型核酸內切酶切割DNA的方法，其特征在于， 步驟7)中所述切割反應中加入金屬離子Fe²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺或者Co²⁺。

5.如權利要求1所述的一種使用耐熱重組HNH型核酸內切酶切割DNA的方法，其特征在于， 步驟7)中所述切割反應中不使用鹽。

6.如權利要求1所述的一種使用耐熱重組HNH型核酸內切酶切割DNA的方法，其特征在于， 步驟7)中使用GVE2HNH型核酸內切酶切割DNA的反應體系為20μL：200ng質粒pET-30aDNA 或者λDNA、20mMTris–HClpH8.0、1mMDTT、100nMGVE2HNH型核酸內切酶、2mMMnCl₂、 0.1mg/mlBSA和10％甘油；切割反應時間為15分鐘。

7.如權利要求1所述的一種使用耐熱重組HNH型核酸內切酶切割DNA的方法，其特征在于， 步驟6)中所述的提取并純化處理方法為對所述細胞進行超聲波破碎、熱處理和鎳離子親和 柱純化。