[發(fā)明專利]一種巨尾桉轉(zhuǎn)化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210019229.0
• 申請(qǐng)日: 2012-01-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102660575A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏新莉;尹偉倫;龐濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12Q1/68;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京雙收知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11241
• 代理人: 盧新;左明坤

1.一種巨尾桉轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：

(1)將目的基因連入含有6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)的表達(dá)載體pCAMBIA1301上，將所述載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105；

(2)將所述農(nóng)桿菌于含有100mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的YEB培養(yǎng)基中，28℃，180轉(zhuǎn)/分鐘，避光搖至OD值為0.4～0.6；8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，沉淀收集菌體；

(3)使用含有乙酰丁香酮50mg/L、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸150mg/L和半乳糖1.8g/L的無(wú)蔗糖MS液體培養(yǎng)基懸浮菌體，懸浮后的菌液OD值仍調(diào)至0.4～0.7；

(4)取巨尾桉組培苗莖段，剪為0.5厘米左右，接種于預(yù)培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為25±2℃的培養(yǎng)室中，暗培養(yǎng)1天，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；

(5)取懸浮后的菌液侵染經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的巨尾桉莖段，侵染時(shí)間為4～7分鐘；侵染后接種至共培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為25±2℃的培養(yǎng)室中，暗培養(yǎng)3天中，進(jìn)行共培養(yǎng)；

(6)將共培養(yǎng)后的莖段轉(zhuǎn)接至篩選階段的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為25±2℃的培養(yǎng)室中，暗培養(yǎng)40～45天，進(jìn)行選擇性培養(yǎng)；

(7)統(tǒng)計(jì)選擇性培養(yǎng)后的愈傷組織誘導(dǎo)率，將產(chǎn)生的愈傷組織接至篩選階段的分化培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度為1500～2000勒克斯、光周期為18小時(shí)/天、溫度為25±2℃的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行芽分化培養(yǎng)；

(8)約25～30天后，將分化得到的芽編號(hào)，并移入新的篩選階段的分化培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行分化培養(yǎng)；

(9)取分化培養(yǎng)中高約2厘米左右的小芽，接入篩選階段的生根培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度為1500～2000勒克斯、光周期為18小時(shí)/天、溫度為25±2℃的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行生根培養(yǎng)，40～45天后將生根巨尾桉幼苗移入土中；

(10)取經(jīng)篩選培養(yǎng)得到的巨尾桉株系葉片進(jìn)行氯酚紅檢測(cè)，轉(zhuǎn)化成功的株系的檢測(cè)液產(chǎn)生變色反應(yīng)；用轉(zhuǎn)化成功的株系提取DNA，以AmCBL1基因正向引物AmCBL1-1和反向引物AmCBL1-2為引物，經(jīng)PCR反應(yīng)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定，確定這些株系的DNA中是否獲得了目的基因。?

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因來(lái)源于超旱生植物沙冬青(Ammopiptanthus?mongolicus(Maxim.)Cheng?f.)，該基因由其特異性啟動(dòng)子AmCBL1P所驅(qū)動(dòng)。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述懸浮后的菌液OD值仍調(diào)至0.5～0.6。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述侵染時(shí)間為5～6分鐘。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述預(yù)培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含苯基噻二唑脲(Thidiazuron，以下簡(jiǎn)稱TDZ)0.5mg/L、萘乙酸(1-naphthlcetic?acid，以下簡(jiǎn)稱NAA)0.1mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述共培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含羧芐青霉素(Carbenicillin，以下簡(jiǎn)稱Car)200mg/L、TDZ?0.5mg/L、NAA?0.1mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述篩選階段的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是含有Car200mg/L、TDZ?0.5mg/L、NAA0.1mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖11g/L和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基。

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述篩選階段的分化培養(yǎng)基中是含有Car?200mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖11g/L和瓊脂7g/L的MS培養(yǎng)基。

9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述篩選階段的生根培養(yǎng)基是含有Car?200mg/L、IBA?0.5mg/L、NAA?0.5mg/L、蔗糖19g/L、甘露糖11g/L和瓊脂7g/L的1/2MS培養(yǎng)基。?