[發明專利]一種rhG-CSF的發酵培養基及其發酵方法

在審

• 申請號: 202111671633.1
• 申請日: 2021-12-31
• 公開（公告）號: CN114350588A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 張貴民;冀成法;馬魯南;劉忠
• 申請（專利權）人: 山東新時代藥業有限公司
• 主分類號: C12N1/38
• 分類號: C12N1/38;C12N1/20;C12P21/02;C12R1/19
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• 代理人: 暫無信息

本發明屬于微生物發酵技術領域，特別涉及rhG?CSF的發酵培養基及發酵方法。本發明通過優化不同時期發酵溫度的控制范圍和發酵pH值控制范圍，改變基礎培養基碳源的添加時間，優化培養基配比和補料量，限制性流加補料，低濃度的IPTG與乳糖協同誘導，更有利于rhG?CSF發酵的高密度高表達。發酵結束，發酵密度OD600值達到100以上，發酵目的蛋白表達量達到77％以上，質粒丟失率在4％以內，本發明的rhG?CSF高密度發酵提高了生產效率，具有很好的應用前景。

技術領域

本發明屬于微生物發酵技術領域，具體涉及一種rhG-CSF的發酵培養基及其發酵方法。

背景技術

粒細胞集落剌激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)具有促進粒系造血 干細胞增殖分化及增強成熟粒細胞功能的作用，對于骨髓移植時促進中性白細胞增加、癌 癥化療時引起的嚴重中性粒細胞缺乏癥、以及再生障礙性貧血伴隨的中性白細胞缺乏癥均 有明顯療效。其早期臨床適應癥為癌癥化療及骨髓移植后的中性粒細胞減少，以后逐步擴 大到各種病因引起的中性粒細胞減少癥。

高密度發酵技術可以提高菌體的發酵密度，提高產物的比生產率，其不但可相應減少 發酵規模和生產批次，還可以縮短生產周期、減少設備投資從而降低生產成本，從而大大 提高產品競爭力。大腸桿菌的遺傳背景研究比較透徹，加之其容易培養，生長速度快，表 達載體豐富、大規模培養工藝成熟、表達量高等特點，使其成為應用最廣泛的基因工程合 成異源蛋白的原核表達系統。

然而，外源基因的高水平表達，不僅涉及宿主、載體和克隆基因三者之間的相互關系， 而且與其所處的環境條件息息相關，因此僅按傳統的發酵工藝進行生產是遠遠不夠的，需 要對影響外源基因表達的因素進行分析，探索出一套適于外源基因高效表達的發酵工藝。

基因工程菌發酵問題中最重要的兩個問題是菌體的高密度發酵和誘導條件的確定。菌 株的高密度生長將導致供氧不足和培養基中大量乙酸的產生，這將極大的影響菌體的生長； 另外，菌體密度的高低與外源蛋白表達量之間并沒有相關性，他們之間的結合點就是誘導 條件的確定。

基因工程菌在發酵過程中重組質粒會出現一定的不穩定性，將導致得不到預期的目的 基因產物及產量。質粒的穩定性受到宿主和質粒的基因型、宿主和質粒的相互作用、基因 表達程度、培養溫度、營養限制和反應器操作方式等多種遺傳和環境因素的影響。基因工 程發酵通常需要高密度菌體培養，以獲得更多的目的產物，然而過高的菌體密度會影響工 程菌的質粒穩定性，目前考察高密度培養過程質粒穩定性的文獻并不多。

合適的誘導劑種類和濃度選擇是基因工程菌成功表達的關鍵。異丙基-β-D-硫代半乳糖 苷(IPTG)毒性較大、成本較高，而乳糖作為二糖，無毒、價廉，本身可以作為碳源使用， 是一種較佳的IPTG替代。而IPTG較乳糖等其他乳糖類似物誘導劑相比是最高效的誘導劑， 因此選用何種誘導劑需要進行實驗驗證。