[發(fā)明專利]腫瘤細(xì)胞PD-L1PD-L2免疫熒光+FISH檢測(cè)試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111598468.1
• 申請(qǐng)日: 2021-12-24
• 公開（公告）號(hào): CN114487415A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭曉敏;薛艷文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/574
• 分類號(hào): G01N33/574;G01N33/58;C12Q1/6886;C12Q1/6841
• 代理公司: 常州中潤(rùn)迅達(dá)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32624
• 代理人: 曹誠(chéng)

1.腫瘤細(xì)胞PD-L1PD-L2免疫熒光+FISH檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括Buffer-Ⅰ、Buffer-Ⅱ、Buffer-Ⅲ、封閉液、PD-1/PD-L1抗體、CD45抗體、二抗、抗體稀釋液、DAPI、陽(yáng)性對(duì)照片、10×CF2固定液、探針、甲酰胺工作液、20×SSC以及BSA溶液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤細(xì)胞PD-L1PD-L2免疫熒光+FISH檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、血液及其他體液的取樣；

S2、樣本的富集：

對(duì)于血液樣本而言，采用“人外周血白細(xì)胞去除試劑盒”進(jìn)行富集；

對(duì)于其他體液樣本而言，采用“人體液擴(kuò)增型腫瘤細(xì)胞檢測(cè)試劑盒”進(jìn)行富集；

S3、樣本的蛋白檢測(cè)：包括檢測(cè)前準(zhǔn)備、免疫熒光染色、復(fù)染和結(jié)果觀察及判斷；

S4、FISH檢測(cè)：包括檢測(cè)前準(zhǔn)備、FISH染色、CD45染色、DAPI復(fù)染和結(jié)果觀察及判斷。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腫瘤細(xì)胞PD-L1PD-L2免疫熒光+FISH檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述S1中血液的取樣過程為：采用EDTA、枸櫞酸鈉、草酸鉀/氟化鈉、肝素、ACD抗凝的5mL真空采血管，采血完畢后立即顛倒混勻8次；其他體液的取樣過程為：將臨床抽取的胸腹水、腦脊液、灌洗液即注入含有抗凝劑的瓶?jī)?nèi)并搖勻，且體液體積＞10ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腫瘤細(xì)胞PD-L1PD-L2免疫熒光+FISH檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述取樣的樣品保存需置于15℃-30℃室溫下，并于12小時(shí)內(nèi)進(jìn)行富集處理，如果樣品采集完畢后，出現(xiàn)了凝塊或溶血的現(xiàn)象則不能用于后續(xù)的檢測(cè)。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腫瘤細(xì)胞PD-L1PD-L2免疫熒光+FISH檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述S2中，血液樣本富集的過程如下：

步驟一：輕柔顛倒混勻，取4mL含抗凝劑的全血至50mL離心管中，補(bǔ)充CS1至45mL。室溫離心1600rpm，8min，吸棄上清至12mL，輕搖離心管混勻沉淀細(xì)胞；

步驟二：將上述液體混勻后，加CS2至45mL，將離心管置于垂直混勻儀混勻，室溫8-10分鐘，20rpm，室溫離心1600rpm，8min，吸棄上清，輕搖離心管重懸沉淀細(xì)胞后，補(bǔ)加CS15mL；

步驟三：洗滌磁微粒：吸取適量磁微粒混懸液，100μL/人份，至2mL EP管中，置于磁力架上1-2分鐘，待溶液澄清后，吸棄澄清溶液，取下EP管，加入1mL CS1，輕柔吹打混勻，于磁力架上靜置1分鐘，吸棄澄清溶液；重復(fù)洗滌3次后，用CS1重懸磁微粒至原體積，將洗好后的磁微粒保存在試管架上；

步驟四：按每份100μL的比例將磁微粒緩慢加入樣本中，加入磁微粒過程中，同時(shí)搖動(dòng)離心管以充分混勻，調(diào)節(jié)水平搖床至100-120rpm，將離心管以35°-40°角傾斜固定于搖床上，室溫?fù)u動(dòng)20-25分鐘；

步驟五：于新50mL離心管中加入3mL CS3，將步驟四中的所有液體輕輕疊加到CS3頂層，然后用1mL CS1清洗離心管壁，并將清洗液轉(zhuǎn)移至CS3頂層，配平后室溫離心300g，5分鐘；

步驟六：離心后，吸取結(jié)合了磁珠的白細(xì)胞沉淀以外的部分，轉(zhuǎn)移至15mL離心管內(nèi)，補(bǔ)加0.01M PBS至14mL，輕柔顛倒混勻后室溫離心2000rpm，8分鐘，棄上清至300μL，沿管壁加入1mL 0.01M PBS，輕柔吹打重懸沉淀細(xì)胞；

步驟七：將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至2mL離心管，靠于磁力架2-3分鐘，轉(zhuǎn)移到新的2ml離心管，重復(fù)靠磁力架一次，將液體轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管，架于15mL離心管上端，室溫離心1500rpm，5分鐘，吸棄上清至100-200μL，充分輕柔吹打混勻10次以上，涂片至載玻片20×20mm²的標(biāo)本框中；

步驟八：將標(biāo)本自然干燥，加80-100μL CF2固定10min，吸去固定液，擺放在玻片盒中，4℃保存。