[發明專利]一種用于檢測HLA-B*5101等位基因的引物組及試劑盒

在審

• 申請號: 202111589384.1
• 申請日: 2021-12-23
• 公開（公告）號: CN114480615A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 楊金鳳;李愛萍;王浩
• 申請（專利權）人: 泰興市人民醫院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司 32243
• 代理人: 盧霞

本發明提供了一種用于檢測HLA?B*5101等位基因的PCR擴增引物組和Taqman探針,包含三對根據HLA?B*5101特異性序列設計的引物及相應三條探針，還包含一對用于篩除HLA?B*5101假陽性的引物及相應一條探針，還包含一對內對照引物及相應一條探針。本發明具有如下技術效果：通過三個反應管確定實驗樣本HLA?B*5101基因陽性與否，通過一個反應管排除HLA?B*5101基因的假陽性結果，通過每個反應孔添加的內對照引物及探針排除樣本HLA?B*5101基因的假陰性結果。

技術領域

本發明涉及用于檢測HLA-B*5101等位基因的方法和試劑盒，屬于生物醫學臨床分子檢測領域。

背景技術

人類白細胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)位于人類6號染色體短臂的21.31區，約含360萬個堿基對，是目前已知的人類染色體中基因密度最高、多態性最豐富的區域，分為HLA-Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類基因。經典的HLA-Ⅰ類基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C三類，經典的Ⅱ類基因一般指DR、DP和DQ，HLA-Ⅲ類基因與前兩類不同，除包含腫瘤壞死因子(TumourNecrosis Factor，TNF)基因、淋巴毒素α(lymphotoxin alpha，LTA)基因、熱休克蛋白基因等具有免疫相關功能的基因外，還包括許多非免疫相關基因。其中，HLA-B是人類基因組中最具多態性的區域，包含超過1600個等位基因。研究報道，HLA與多種疾病密切相關，如強直性脊柱炎、貝賽特氏癥、乳糜瀉等。

白塞病(Behcet’s thsease，BD)是一種病因未明的多系統受累的慢性炎性疾病，現多傾向為一種自身免疫性疾病，即BD患者首先具有一定的遺傳易感性，在病原體感染后繼發機體免疫功能失調而引發本病。許多研究認為BD與HLA-B51抗原間存在極強的相關性，這些結果提示，BD患者存在著某種易感基因，這種易感基因可能就是HLA-B51，并可能是BD易感的遺傳標志。HLA-B51與BD具有強相關性提示，HLA-B51基因特別是等位基因HLA-B*5101是BD的一種標志，但尚不能證明HLA-B*5101本身直接地導致了BD。基于以上資料，推測HLA-B51分子可能觸發了BD的發生，因為某些引起BD的外源性因子的抗原與HLA-B51抗原之間具有高度的親和性。由此可見，HLA-B*5101的檢測在白塞病的診斷中有著重要意義。

由此可見，快速而準確地檢測HLA*B5101等位基因對臨床診斷、疾病鑒別及醫學研究具有重要意義。目前國內市場上常用的上述基因檢測方法主要有PCR-SSP法、PCR-SSOP法、SYBR Green I及Taqman熒光定量PCR法等。PCR-SSP(sequence specific primer)即序列特異引物引導的PCR反應，是目前被廣泛采用的檢測方法，其基本方法是設計一系列等位基因型特異性引物，通過特定PCR反應體系擴增各等位基因型特異性DNA片段，產生相對應的特異性擴增產物條帶，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，此方法成本低，但操作復雜，無法自動獲取結果，準確度也有待提高。PCR-SSOP即多聚酶鏈反應寡聚核苷酸探針雜交，先采用位點特異性引物對HLA-B位點進行擴增，擴增產物包括HLA-B位點的所有等位基因序列，再根據堿基互補原則，將PCR產物經化學變性解鏈后，單鏈與固化在2條尼龍膜上的序列特異寡核苷酸探針在特定條件下雜交，經洗膜，加入標記有堿性磷酸鹽的抗生物蛋白鏈菌素與生物素及底物反應，對擴增片段進行分析鑒定。SSOP反向雜交法操作繁瑣，耗時長，需嚴格控制實驗條件，否則會導致錯配，影響結果準確性。熒光定量PCR的基本原理是在反應體系中加入熒光分子，通過熒光信號的按比例增加來反應DNA量的增加，從而對PCR產物進行實時檢測。SYBR GreenⅠ是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料，其與DNA的結合是非特異性的，此方法雖然操作簡便、快速，但缺乏特異性，準確性差。Taqman熒光定量PCR法克服了以上不足，操作簡便、快速，特異性高，并可實現高通量檢測。一般來講，Taqman熒光定量PCR法通過設計一對或多對HLA-B*5101特異性引物及相應探針，進行PCR擴增，考慮到HLA多態性非常高，結果易出現假陽性，從而影響其準確性。因此，本領域急需一種操作簡便、快速，且準確度高的檢測方法。