[發明專利]三七細胞外囊泡的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 202111567193.5
• 申請日: 2021-12-20
• 公開（公告）號: CN114470020B
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發明（設計）人: 朱蕓;滕兆偉
• 申請（專利權）人: 玉溪市人民醫院
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;A61K36/258;A61P17/18;A61K125/00
• 代理公司: 武漢藍寶石專利代理事務所(特殊普通合伙) 42242
• 代理人: 張文靜

本發明提供了一種三七細胞外囊泡的制備方法及其應用。本發明將植物中藥三七主根碾磨過濾后采用差速離心的方法進行提取，通過精確的控制各步驟條件，制備得到的三七細胞外囊泡輪廓清晰，結構完整。進一步對提取得到的細胞外囊泡進行研究，發現其可以成功的轉染至HSF細胞中，并對其凋亡和增殖產生影響。

技術領域

本發明涉及分子生物和醫藥領域，具體涉及一種三七細胞外囊泡的制備方法及其應用。

背景技術

人類皮膚衰老是一個不可避免的過程，主要表現為皮膚外觀的變化，如皮膚松弛、失去彈性和皺紋的形成。人們普遍認為，皮膚衰老是由各種內因和外因共同驅動的。其中，真皮層纖維細胞是分泌細胞外基質的主要皮膚基質細胞。真皮層細胞可以合成或分泌膠原蛋白、彈性蛋白、透明質酸等細胞外基質成分。這些細胞外基質成分經加工組裝成纖維，可以賦予皮膚彈性和韌性，幫助皮膚保持年輕。然而，在衰老過程中，細胞外基質逐漸降解并產生一些有害物質，極大的損害纖維細胞的功能。隨著社會的進步和科技的發展，人們對衰老的認識不斷深入的同時，對抗衰老的愿望也日益強烈，這就為抗衰老技術產品的開發提供了巨大的市場空間。

目前市面上已有各種方式來延緩皮膚衰老，比如各種美容產品、牛血清蛋白制劑等，但是這些產品大多數只起到物理性的作用。因此，開發更多安全有效，無毒無害的方法去調動皮膚的內在活力，從細胞水平上延緩衰老具有重要的研究意義。

目前已有用干細胞和尿液來源的細胞外囊泡來延緩皮膚層纖維細胞和真皮層纖維細胞的衰老的應用，但是不同的細胞外囊泡顆粒千差萬別，生物學功能和運轉特性也不盡相同。因此尋找一種能有效作用于人皮膚層纖維細胞的植物細胞外囊泡，通過提取并研究其是否可以有效作用于人真皮層纖維細胞，這對于推動中藥細胞外囊泡的研究意義重大。

發明內容

針對現有技術所存在的技術問題，本發明提供了一種新鮮三七細胞外囊泡的制備方法和應用。通過該方法可以有效的對三七細胞中的外囊泡進行提取，提取得到的細胞外囊泡可以成功的轉染至HSF細胞中，并對其凋亡和增殖產生影響。

本發明通過以下技術方案來實現上述技術目的：

本發明提供一種三七外囊泡的制備方法，包括以下步驟：

在溫度≤37℃的條件下碾磨三七主根，將碾磨后的三七主根加入到緩沖溶液中，用脫脂紗布過濾掉殘渣，收集液體；

將收集的液體在≤6℃，第一預設轉速下離心并過濾，收集濾液并轉移到超濾離心管中；

將超濾離心管中的濾液在≤6℃，第二預設轉速下重復離心，棄去超濾管底部的水；

將超濾濃縮后的液體在第三預設轉速下離心70～100min，收集沉淀；

用預冷的緩沖液重懸沉淀，并在第四預設轉速下離心收集沉淀；

將收集的沉淀再次重懸即得；

其中第一預設轉速為800～1500g，第二預設轉速為1500～3000g，第三預設轉速為8000～12000g。具體地，第一預設轉速為1000g，第二預設轉速為?2000g，第三預設轉速為100000g。

本發明將新鮮植物中藥三七碾磨過濾后離心，制備得到的三七細胞外囊泡輪廓清洗，結構完整。該方法中，三七主根碾磨時應保證機身溫度不超過?37℃。

另外，本發明還采用差速離心的方法進行提取，在該方法中，需要嚴格控制離心次數、離心時間和轉速，時間過短或者轉速過小，無法充分提取外囊泡，次數過多或者轉速過大，又會破壞外囊泡的結構，導致外囊泡的產率下降。

本發明中所用的緩沖液優選為PBS緩沖液，其制備方法如下：