[發(fā)明專(zhuān)利]一種黃素單加氧酶突變體及其制備和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111516213.6
• 申請(qǐng)日: 2021-12-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114317469B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王鳳華;劉逸寒;郭澤輝;路福平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/02
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12P13/04;C12R1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酶活性提升的黃素單加氧酶突變體及其制備與應(yīng)用。通過(guò)全基因合成來(lái)自大蒜(Allium?sativum)的野生型黃素單加氧酶基因，利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)野生型黃素單加氧酶基因進(jìn)行隨機(jī)突變，得到黃素單加氧酶突變體N91G，及其編碼基因asfmom，重新構(gòu)建重組質(zhì)粒，并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌和畢赤酵母中的高效表達(dá)，通過(guò)發(fā)酵、提取等技術(shù)獲得活性進(jìn)一步提高的黃素單加氧酶。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酶活性提升的黃素單加氧酶突變體及其制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃素單加氧酶(Flavin-containing?monooxygenase,FMO,EC?1.14.13.8)，是一種能在C、N和S原子上加氧的酶，催化氧氣的一個(gè)氧原子與電子供體提供的氫原子結(jié)合生成水，另外一個(gè)氧原子插入有機(jī)底物，形成新的產(chǎn)物，這一反應(yīng)嚴(yán)格依賴(lài)于輔因子。蒜氨酸，是大蒜中獨(dú)有的含硫化合物，可作為天然防腐劑，對(duì)各種真菌的殺滅作用強(qiáng)度與化學(xué)防腐劑苯甲酸、山梨酸相近似；具有抗氧化和清除自由基的活性，可以延緩衰老；同時(shí)具有抗菌殺毒、抗腫瘤、協(xié)同降血壓等重要的藥理功效。因此，可以利用黃素單加氧酶催化脫氧蒜氨酸制備具有多種生物活性功能的蒜氨酸，這些酶法合成的蒜氨酸可應(yīng)用于食品防腐劑、食品調(diào)味料、保健食品、藥物等，具有極大的利用價(jià)值和應(yīng)用前景。

目前，人們主要通過(guò)提取法和化學(xué)合成法獲得蒜氨酸，酶法合成使用較少。然而，酶法合成因其安全、高效和高產(chǎn)等特點(diǎn)，逐漸受到關(guān)注。酶法合成優(yōu)勢(shì)主要在于以下幾點(diǎn)：首先酶法合成比化學(xué)法合成更安全和綠色，成本更低；其次，提取法效率低，提取過(guò)程由于蒜氨酸與蒜氨酸酶反應(yīng)，產(chǎn)生大量蒜素，從而降低了蒜氨酸的品質(zhì)；酶法合成蒜氨酸，利用了微生物生長(zhǎng)繁殖快，易于控制等特點(diǎn)，可以按照意愿大量合成蒜氨酸。

黃素單加氧酶的應(yīng)用嚴(yán)格受限于其活性、專(zhuān)一性、最適溫度和pH值、溫度和酸堿穩(wěn)定性、溶劑耐受性等酶學(xué)性質(zhì)。因此，需要不斷提高酶的活性，獲得高產(chǎn)的蒜氨酸，從而實(shí)現(xiàn)蒜氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)。然而，已報(bào)道的能催化脫氧蒜氨酸生成蒜氨酸的黃素單加氧酶極少，而且催化效率和轉(zhuǎn)化率較低。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，酶活性低不僅限制了其應(yīng)用范圍，還增加了工業(yè)應(yīng)用成本，為實(shí)際應(yīng)用帶來(lái)困難。因此，篩選到高活性的黃素單加氧酶具有重要研究意義。為了解決這些實(shí)際應(yīng)用問(wèn)題，研究者通過(guò)蛋白質(zhì)工程技術(shù)來(lái)改善天然酶的功能及特征，以滿(mǎn)足工業(yè)上的應(yīng)用，例如定向進(jìn)化、理性設(shè)計(jì)、化學(xué)修飾等。

定向進(jìn)化是改善酶的功能和特性的重要手段之一，尤其在提高酶的催化活性方面。它屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計(jì)，不需要獲得蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)以及催化位點(diǎn)等信息，只需對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸序列做隨機(jī)突變。它可以在實(shí)驗(yàn)室里模擬自然選擇的進(jìn)化機(jī)制，通過(guò)分子生物學(xué)手段在體外快速建立含大量目的蛋白編碼基因的突變體文庫(kù)，并通過(guò)高通量的定向篩選方法，快速獲得符合人類(lèi)應(yīng)用價(jià)值的蛋白質(zhì)突變體。定向進(jìn)化的核心步驟主要包括構(gòu)建具有多樣性的突變體文庫(kù)和高通量的篩選方法。常用的包括：易錯(cuò)PCR、飽和突變、DNA改組、交錯(cuò)延伸PCR等。定點(diǎn)突變，即理性設(shè)計(jì)，在蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)、催化機(jī)制等基礎(chǔ)上，有的放矢對(duì)其進(jìn)行改造，且只能對(duì)天然酶蛋白質(zhì)中的少數(shù)氨基酸進(jìn)行替換、刪除或插入，不改變酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)酶功能和特性的改造有限。因此，對(duì)于結(jié)構(gòu)與功能未知的酶，定向進(jìn)化可在一定程度上彌補(bǔ)理性設(shè)計(jì)的不足。

大腸桿菌外源基因表達(dá)系統(tǒng)是目前研究得最深入、發(fā)展也最完善的表達(dá)系統(tǒng)，許多有價(jià)值的多肽和蛋白質(zhì)已在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。它已作為一種安全、高效、多功能和極具開(kāi)發(fā)潛力的微生物菌種已廣泛地應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、衛(wèi)生、食品、畜牧業(yè)、水產(chǎn)及科研領(lǐng)域。