[發明專利]一種人神經干細胞制劑及其制備方法

有效

• 申請號: 202111514134.1
• 申請日: 2021-12-13
• 公開（公告）號: CN114099548B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 謝再東;王軍霞;潘春雷;吳鋒;殷鑒強;劉定生;朱建榮
• 申請（專利權）人: 領航干細胞再生醫學工程有限公司
• 主分類號: A61K35/30
• 分類號: A61K35/30;A61K9/08;C12N5/0797;A61K47/08;A61K47/26;A61K47/42;A61P25/28;A61P9/10;A61P25/00;A61P25/08;A61P25/16;A61P25/14;A61P21/00
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1.一種人神經干細胞制劑，其特征在于：所述的人神經干細胞制劑由神經干細胞和基質溶液組成，基質溶液由右旋糖酐40葡萄糖注射液，10-15%人血白蛋白，0.1-0.5ug/ml胞二磷膽堿鈉注射液,20-50ug/ml神經節苷脂鈉，1-10?uM輔酶Q10構成。

2.根據權利要求1所述的一種人神經干細胞制劑，其特征在于：所述的神經干細胞是由人胚胎干細胞經體外誘導分化、擴增獲得的，神經干細胞制劑中神經干細胞的濃度為1-10×10⁶/ml。

3.根據權利要求1所述的一種人神經干細胞制劑，其特征在于：所述的右旋糖酐40葡萄糖注射液中右旋糖酐濃度為6%，葡萄糖濃度為5%。

4.一種人神經干細胞制劑的制備方法，其特征在于：人胚胎干細胞H9培養：將人胚胎干細胞培養于預先包被VITRONECTUIN?XF的T25培養瓶中，加入TeSRTM-E8培養基，每天換液，待克隆長至80%左右匯合度時，用分離酶在37度孵育3-5min進行消化，將消化后的ESC凍存、傳代或誘導分化；

神經干細胞的誘導：將消化后的ESC懸浮于未經組織處理的培養瓶或培養皿內，加入神經誘導培養基，培養7-10天，每2天換液一次；將懸浮的細胞球貼壁培養于預先包被有matrigel的培養瓶或培養皿內，加入不含SB431542和DMH1的神經誘導培養基培養培養10-12天，觀察到大量的神經干細胞產生；神經干細胞的培養條件為37℃,5%的CO₂濃度的培養箱；

神經干細胞的擴增：將神經干細胞加入分離酶，37℃孵育3-5?min,加入2倍培養基終止消化，將細胞輕輕吹下，1400?rpm,離心3-5?min,將底部細胞沉淀懸浮于神經干細胞擴增培養基中擴增，每3天將神經球機械切割成小球并補加2倍量的培養基連續培養擴增，即可獲得大量的神經干細胞；

神經干細胞鑒定：吸取培養基，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛室溫孵育10?min，PBS?洗滌3次，用封閉液室溫下封閉1?h，PBS洗滌3次，加入Nestin抗體，4度孵育過夜；PBS洗滌3次，加入二抗，室溫下避光孵育2?h,PBS漂洗3次,避光，用EVOSFL?auto全自動熒光顯微成像系統檢測各標記物的表達情況并拍照；

神經干細胞制劑的制備：100?ml基質溶液的制備，10-15?ml人血白蛋白，0.2-1?ul?100mg/2?ml胞二磷膽堿鈉注射液,40-100?ul?100?mg/2?ml神經節苷脂鈉，32-320?ul?5mg/2ml輔酶Q10,用右旋糖酐40葡萄糖注射液補至100?ml,放于微型振蕩器充分震蕩，180rpm?,震蕩30s-1?min混勻，放于4℃環境下進行保存；

將擴增的神經干細胞倒入50?ml離心管內，1400rpm，離心3-5?min,將底部沉淀加入3-5ml分離酶，37℃孵育3-5?min，每1分鐘搖晃一次，待細胞球明顯變小時，加入2倍培養基終止消化，反復輕輕吹打，1400?rpm,離心3-5?min，用生理鹽水將細胞洗滌2-3次，經100?目篩網過濾后，計數，細胞以1-10×10⁶/ml的密度懸浮在基質溶液中，即制備成神經干細胞制劑；

所述的神經干細胞的誘導步驟中神經誘導培養基以DMEM/F12為基礎培養基，含有1%N2，20-50?ng/mlbFGF，2-10uM?SB431542，2-10uM?DMH1；

所述的神經干細胞的擴增步驟中神經干細胞擴增培養基以DMEM/F12為基礎培養基，含有0.5-2%血小板裂解物，0.8-1.5×ITS，0.5-1%?N2；1-2%?B27；20-50?ng/ml人堿性成纖維生長因子,10-20?ng/ml?IGF-II,β-巰基乙醇。