[發(fā)明專利]一種免疫細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111513176.3
• 申請(qǐng)日: 2021-12-12
• 公開（公告）號(hào): CN114097770B
• 公開（公告）日: 2022-11-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州中贏生物醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 南京普睿益思知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32475
• 代理人: 何薇

本發(fā)明公開了一種免疫細(xì)胞凍存液，其組分包括：聚乙二醇3?5mg/ml；壬基酚聚氧乙烯醚?100.1?0.5μg/ml；1,3?丙二醇1.2?3mg/ml；葡聚糖0.1?0.5ml/ml；苜蓿素0.01?0.05mg/ml；海藻糖0.2?0.6mg/ml；姜黃素0.01?0.06ml/ml；非必須氨基酸5?8mg/ml；人血白蛋白10?18mg/ml。本發(fā)明還公開了一種免疫細(xì)胞的凍存應(yīng)用方法。本申請(qǐng)?jiān)趦龃嬉褐刑砑咏S素，與海藻糖配合，不僅對(duì)凍存細(xì)胞具有極好的保護(hù)作用，同時(shí)細(xì)胞復(fù)蘇后細(xì)胞活力極有優(yōu)秀，即使對(duì)于大規(guī)模免疫細(xì)胞的凍存，細(xì)胞回收率也可保持較高水平，凍存時(shí)間可達(dá)幾年甚至更長(zhǎng)，有效保證凍存液成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫細(xì)胞凍存技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種免疫細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用方法。

背景技術(shù)

免疫細(xì)胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。免疫細(xì)胞可以分為多種，在人體中各種免疫細(xì)胞擔(dān)任著重要的角色，從血液中分離出來的單個(gè)核細(xì)胞包括：T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞等，是免疫細(xì)胞治療中的初始細(xì)胞來源，經(jīng)各類細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)，得到一群具有高效殺傷活性的免疫細(xì)胞群。

細(xì)胞凍存技術(shù)作為一種保存細(xì)胞的有效方法在生物學(xué)領(lǐng)域已有深入廣泛的應(yīng)用，通過對(duì)供體的免疫細(xì)胞深低溫保存保持其活力和功能，免疫細(xì)胞在-70℃～-80℃凍存，細(xì)胞活性會(huì)隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)迅速下降，在-196℃時(shí)細(xì)胞生物學(xué)過程幾乎停止，因此要長(zhǎng)期保存免疫細(xì)胞，液氮溫度是最佳的儲(chǔ)存溫度。

細(xì)胞冷凍技術(shù)無論對(duì)臨床還是基礎(chǔ)研究均具有重要意義，細(xì)胞凍存經(jīng)常采用滲透性保護(hù)劑，例如甘油和二甲基亞砜(DMSO)兩種，而甘油作為冷凍保護(hù)劑凍存的免疫細(xì)胞存活率較低，但DMSO卻可以迅速透入細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，使水分在細(xì)胞凍結(jié)前透出細(xì)胞外形成冰晶，成為免疫細(xì)胞凍存最理想的冷凍保護(hù)劑。目前DMSO作為常用的細(xì)胞冷凍保存劑，不能長(zhǎng)時(shí)間有效保存大規(guī)模培養(yǎng)的免疫細(xì)胞，復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)量及活力都無法滿足臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)。

因而，發(fā)明人致力于尋找在未添加DMSO的前提下，能夠促進(jìn)冷凍保存下免疫細(xì)胞存活率，并達(dá)到能夠長(zhǎng)期保存免疫細(xì)胞效果的凍存液，具有極好的研究前景。

發(fā)明內(nèi)容

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種免疫細(xì)胞凍存液及其應(yīng)用方法。

本發(fā)明提出的一種免疫細(xì)胞凍存液，其組分包括：

優(yōu)選地，所述非必須氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。

海藻糖廣泛存在于低等動(dòng)物、藻類、細(xì)菌、真菌、酵母中，是應(yīng)激代謝的重要產(chǎn)物，具有保護(hù)生物細(xì)胞和生物活性物質(zhì)在脫水、高滲透壓、有毒試劑等不良環(huán)境條件下活性免遭破壞的功能。

姜黃素是一種天然化合物，是從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取的一種二酮類化合物，是植物界很稀少的具有二酮結(jié)構(gòu)的色素，具有良好的抗炎和抗癌特性。

苜蓿素為類黃酮類植保素，是豆科植物紫苜蓿的濃縮提取物，是紫苜蓿受到外界刺激或感染病菌后合成并積累的具有抗逆活性的小分子化合物。

優(yōu)選地，所述的免疫細(xì)胞凍存液，其組分包括：

優(yōu)選地，所述的免疫細(xì)胞凍存液，其組分包括：

一種免疫細(xì)胞凍存液的應(yīng)用方法，包括如下步驟：

取外周血于離心管中，20-30℃離心30-40min，去除上層血漿，下層細(xì)胞加入等體積的PBS緩沖液混合均勻，加到Ficoll層上使分層清晰，離心后吸取外周血單個(gè)核細(xì)胞層，加入PBS緩沖液混勻，離心，得到外周血單核細(xì)胞；