[發明專利]檢測西農薩能奶山羊DGAT1基因CNV標記的方法及其應用

在審

• 申請號: 202111509328.2
• 申請日: 2021-12-10
• 公開（公告）號: CN114107519A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 劉梅;楊龍;程杰;陳鈺焓;鄧秋純;龍江松;藍賢勇;陳宏
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 王峰剛

本發明屬于家畜分子生物學檢測技術領域，公開了一種檢測西農薩能奶山羊DGAT1基因CNV標記的方法及其應用，所述檢測西農薩能奶山羊DGAT1基因CNV標記的方法包括：以西農薩能奶山羊基因組DNA為模板，以引物對P1以及引物對P2為引物，分別通過QPCR擴增DGAT1基因的CNV區域，然后根據定量結果鑒定西農薩能奶山羊DGAT1基因的拷貝數變異。本發明提供的奶山羊DGAT1基因拷貝數變異檢測方法，不受年齡的限制，可用于母羊的早期選育，甚至在剛出生時就可進行選擇；檢測DGAT1基因拷貝數變異的方法準確可靠、操作簡便；DGAT1基因拷貝數變異位點的檢出，為奶山羊的分子標記輔助選擇提供科學依據。

技術領域

本發明屬于家畜分子生物學檢測技術領域，尤其涉及一種檢測西農薩能奶山羊DGAT1基因CNV標記的方法及其應用。

背景技術

目前，奶山羊作為畜牧行業奶制品以及肉制品的主要來源，而羊奶相比較于牛奶，具有價格優惠，產量大的特點。隨著基因組學和生物信息學等學科的迅猛發展，動物育種理論和技術正在發生重大變化，奶山羊育種的方向由常規的表型選育向分子育種發展。目前，羊分子育種研究主要集中在以分子標記為基礎的標記輔助選擇方面。分子育種，即分子標記輔助選擇(molecular mark-assist selection，MAS)，該技術是借助DNA分子標記對遺傳資源或育種材料進行選擇，對畜禽的綜合性狀進行品種改良。在畜禽育種中，通過對生長性狀密切相關，并且與數量性狀緊密關聯的DNA標記的選擇，達到早期選種和提高育種值準確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進展。

拷貝數變異(Copy Number Variations，CNVs)，作為一種新發現的基因組亞顯微水平結構變異類型，是指基因組DNA中較大片段的缺失或重復現象，涉及的片段大小在50bp到數Mb之間，包括拷貝數增加(Copy number gain)和拷貝數減少(Copy number loss)。

DGAT1(二酰基甘油O-酰基轉移酶1)在三酰基甘油合成中起基礎作用。DGAT1可編碼跨膜蛋白，是催化甘油三酯合成的最后和限制步驟的關鍵代謝酶。在奶牛中，已發現DGAT1位于對產奶量和組成份有重要影響的QTL中。在反芻動物中，多個DGAT1基因SNPs已被鑒定為對產奶性狀和肉質具有重大影響的關鍵分子標記。但是，與DGAT1相關的CNV還未見報道。發明人前期研究首次利用山羊52K SNP芯片技術，在國外山羊中檢測到了DGAT1基因區域存在CNV。但是，DGAT1 CNV在中國山羊中是否存在，以及其是否山羊的產奶性狀存在影響尚未可知。

CNV常用的檢測方法主要分為在全基因組范圍內檢測未知CNV和用于定點檢測或驗證已知CNV兩類。基因組未知CNV常用的檢測方法有芯片法和測序法，但是，這兩種方法受檢測平臺的局限，而且價格昂貴；對于已確定的CNV的檢測，通常是采用基于PCR技術和雜交技術的一些方法。其中，實時熒光定量PCR(QPCR)最為常用。根據QPCR所使用的熒光化學方法的不同，主要分為熒光染料嵌入法和熒光雜交探針法兩類。PCR反應體系中加入過量的SYBR Green染料分子，能特異性地滲入DNA雙鏈并發射熒光信號，而游離的染料分子則僅有很低的熒光本底幾乎不發光，從而確保信號的增加與PCR產物的增加同步，可通過檢測熒光信號的強度來反映基因組DNA的數量。通過對目的基因(具有拷貝數變異)及參考基因(無拷貝數變異)進行相對定量，根據2^-ΔΔCt方法統計檢測樣本候選基因的拷貝數。染料法的優點是實驗成本低、無需設計合成探針、使用方便，可以檢測目的片段的絕對拷貝數。因此，熒光染料嵌入法作為先前方法，普適度高，另一點它的實驗成本低，受認同程度高。。

通過上述分析，現有技術存在的問題及缺陷為：亟需一種新的能夠大樣本檢測DGAT1 CNV在中國山羊中的存在情況，并探索其對山羊的產奶性狀是否存在影響。。

解決以上問題及缺陷的難度為：由于之前尚未在中國山羊中開展相關研究，且大樣本進行試驗檢測的方法尚需探索。