[發明專利]生產尿嘧啶糖基化酶的方法及用于該方法的雙載體系統

在審

• 申請號: 202111497519.1
• 申請日: 2021-12-09
• 公開（公告）號: CN114480349A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 杜軍;宋輝;曹文剛;肖曉文
• 申請（專利權）人: 北京擎科生物科技有限公司;湖北擎科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京匯知杰知識產權代理有限公司 11587
• 代理人: 楊巍;柴春玲

本發明涉及生物技術領域，更具體地，本發明涉及一種生產尿嘧啶糖基化酶(UDG)的方法及用于該方法的雙載體系統。該方法可以顯著提高了UDG的溶解性，從而增加UDG的表達量和產量，同時保證了UDG的活性、穩定性和純度。

技術領域

本發明的涉及生物技術領域，更具體地，本發明涉及一種生產尿嘧啶糖基化酶的方法及用于該方法的雙載體系統。

背景技術

尿嘧啶糖基化酶(UDG)是一種特異性降解含尿嘧啶堿基DNA的水解酶，主要用于PCR殘留污染的控制。依據UDG蛋白的熱穩定性分為耐熱型UDG和熱敏型UDG(不耐熱)。耐熱型UDG由于熱穩定好，使用過程中很難徹底被熱滅活，因此會影響下游檢測技術(如qPCR、多重PCR、體外診斷試劑盒等)的靈敏度。因此，熱敏型UDG更加適合兼容到qPCR等高靈敏度檢測技術中。

目前熱敏UDG主要起源于嗜冷海洋生物，如大西洋鱈魚和南極細菌，來源于這些海洋生物的UDG的耐熱性能差，其在表達過程中易形成包涵體而導致溶解度較低，而在純化過程中易降低活性和丟失活性，最終導致UDG的產量較低。因此，UDG基因的挖掘、表達載體的構建方式、表達和純化工藝都是開發該酶的技術難點。

因此，本領域亟需一種UDG的生產方法，該方法可以顯著提高UDG的溶解性，增加UDG的表達量和產量，同時保證UDG的活性、穩定性和純度。

發明內容

如上所述，現有的UDG生產方法，由于UDG在表達過程中溶解度較低，而在純化過程中又易活性降低和活性丟失，最終導致UDG的產量較低。因此，本領域亟需一種UDG的生產方法，該方法可以顯著提高了UDG的溶解性，從而增加UDG的表達量和產量，同時保證UDG的活性、穩定性和純度。

有鑒于此，在第一方面，本發明提供了一種生產尿嘧啶糖基化酶(UDG)的方法，所述方法包括以下步驟：

a)提供一種表達細胞，所述表達細胞包含能夠表達所述UDG的第一載體和能夠表達分子伴侶素系統GroEL-GroES的第二載體，其中，所述UDG的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，并且所述GroEL和GroES的氨基酸序列分別如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；

b)在第一誘導條件下誘導所述表達細胞表達所述分子伴侶素系統GroEL-GroES；

c)在第二誘導條件下誘導所述表達細胞同時表達所述分子伴侶素系統GroEL-GroES和所述UDG。

在第二方面，本發明提供了一種雙載體系統，所述雙載體系統包含：

(1)第一載體，所述第一載體能夠表達尿嘧啶糖基化酶(UDG)，所述UDG的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及

(2)第二載體，所述第二載體能夠表達分子伴侶素系統GroEL-GroES，所述GroEL和GroES的氨基酸序列分別如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

在第三方面，本發明提供了一種表達細胞，所述表達細胞包含本發明第二方面的雙載體系統。

在第四方面，本發明提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含：本發明第三方面的表達細胞、以及用于指導如何利用該試劑盒來生產尿嘧啶糖基化酶(UDG)的說明書。

本發明的有益效果包括以下一個或者多個：

1)提供了一種生產尿嘧啶糖基化酶(UDG)的方法，該方法可以顯著提高UDG的溶解性，從而增加UDG的表達量和產量；

2)提供了一種可用于生產易受溫度影響的熱敏型UDG的方法，通過低溫誘導和低溫純化保證了熱敏型UDG的活性和穩定性；

附圖說明