[發明專利]生產尿嘧啶糖基化酶的方法及用于該方法的雙載體系統

在審

• 申請號: 202111497519.1
• 申請日: 2021-12-09
• 公開（公告）號: CN114480349A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 杜軍;宋輝;曹文剛;肖曉文
• 申請（專利權）人: 北京擎科生物科技有限公司;湖北擎科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京匯知杰知識產權代理有限公司 11587
• 代理人: 楊巍;柴春玲

1.一種生產尿嘧啶糖基化酶(UDG)的方法，所述方法包括以下步驟：

a)提供一種表達細胞，所述表達細胞包含能夠表達所述UDG的第一載體和能夠表達分子伴侶素系統GroEL-GroES的第二載體，其中，所述UDG的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，并且所述GroEL和GroES的氨基酸序列分別如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；

b)在第一誘導條件下誘導所述表達細胞表達所述分子伴侶素系統GroEL-GroES；

c)在第二誘導條件下誘導所述表達細胞同時表達所述分子伴侶素系統GroEL-GroES和所述UDG。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述第一誘導條件為使用第一誘導劑(例如阿拉伯糖)于16℃至37℃誘導5小時至0.5小時，優選于25℃誘導3小時，以誘導所述表達細胞表達所述分子伴侶素系統GroEL-GroES；所述第二誘導條件為使用所述第二誘導劑(例如阿拉伯糖)和第三誘導劑(例如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))于16℃至20℃、優選于16℃誘導16小時至20小時，以誘導所述表達細胞同時表達所述分子伴侶素系統GroEL-GroES和所述UDG，其中所述第二誘導劑誘導所述表達細胞表達所述分子伴侶素系統GroEL-GroES，所述第三誘導劑誘導所述表達細胞表達所述UDG。

3.根據權利要求2所述的方法，其中，所述第一誘導劑和所述第二誘導劑的濃度各自獨立地為0.001％至1.0％，優選為0.4％；所述第三誘導劑的終濃度為0.1mM至1.0mM，優選為0.1mM。

4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其中，在步驟a)中，所述表達細胞是通過分別用所述第一載體和第二載體轉化同一宿主細胞獲得的；

優選地，所述第一載體和所述第二載體是通過不同轉化方法來轉化所述宿主細胞的，所述轉化方法為例如熱激法和/或電擊法；更優選地，所述第一載體是通過熱激法來轉化所述宿主細胞的，所述第二載體是通過電擊法來轉化所述宿主細胞的。

優選地，所述第一載體和所述第二載體為質粒；更優選地，所述第一載體為表達所述UDG的質粒，例如pET21a、pHUE、pET20b、pET-22b、pET-28a、或pET-32a質粒，優選為pET21a質粒；所述第二載體為表達所述分子伴侶素系統GroEL-GroES的質粒，例如pBAD33質粒；

優選地，所述宿主細胞為原核細胞，例如細菌細胞，如大腸桿菌(Escherichia coli)。

5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，所述方法還包括步驟d)：破碎在步驟c)中得到的表達細胞，并通過親和層析在4℃至10℃的溫度下純化所述UDG；

優選地，所述第一載體還表達親和標簽，例如His標簽、FLAG標簽、HAT標簽、HPC標簽、MBP標簽、NusA標簽、UB標簽、或GST標簽，優選6×His標簽，并且所述親和層析利用所述親和標簽來進行。

6.一種雙載體系統，所述雙載體系統包含：

(1)第一載體，所述第一載體能夠表達尿嘧啶糖基化酶(UDG)，所述UDG的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及

(2)第二載體，所述第二載體能夠表達分子伴侶素系統GroEL-GroES，所述GroEL和GroES的氨基酸序列分別如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

7.根據權利要求6所述的雙載體系統，其中，所述第一載體和所述第二載體為質粒，優選地，所述第一載體為表達所述UDG的質粒，例如pET21a、pHUE、pET20b、pET-22b、pET-28a、或pET-32a質粒，優選為pET21a質粒；所述第二載體為表達所述分子伴侶素系統GroEL-GroES的質粒，例如pBAD33質粒。

8.根據權利要求6或7所述的雙載體系統，其中，所述第一載體還表達親和標簽，例如His標簽、FLAG標簽、HAT標簽、HPC標簽、MBP標簽、NusA標簽、UB標簽、或GST標簽，優選6×His標簽。