[發(fā)明專(zhuān)利]一種靶向三疣梭子蟹dmy基因的SgRNA及三疣梭子蟹基因編輯的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111474749.6
• 申請(qǐng)日: 2021-12-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114134150B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈少婷;呂建建;張文;金玲;蘭偉康;劉萍;李健
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/113
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/113;C12N15/89;C12N5/073
• 代理公司: 青島合創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

本發(fā)明公開(kāi)了一種靶向三疣梭子蟹dmy基因的SgRNA及三疣梭子蟹基因編輯的方法。所述基因編輯的方法主要步驟包括：（1）SgRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成和Cas9?mRNA制備；（2）SgRNA和Cas9?mRNA的混合；（3）三疣梭子蟹一胞期受精卵的獲取及顯微注射；（4）對(duì)注射后的早期胚胎樣品突變情況進(jìn)行檢測(cè)，最終得到經(jīng)過(guò)基因編輯的三疣梭子蟹胚胎。同時(shí)，本發(fā)明還在靶點(diǎn)合成設(shè)計(jì)過(guò)程中得到了一種靶向三疣梭子蟹dmy基因的SgRNA。所述方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)三疣梭子蟹受精卵進(jìn)行基因編輯，能夠?yàn)槿嗨笞有坊蚬δ艿难芯亢屯蛔兤废档呐嘤於ɑA(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靶向三疣梭子蟹dmy基因的SgRNA及三疣梭子蟹基因編輯的方法。

背景技術(shù)

三疣梭子蟹( Portunus?trituberculatus)屬甲殼綱、十足目、梭子蟹科、梭子蟹屬，是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖生物。三疣梭子蟹營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)。然而，根據(jù)2021年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒，2020年，全國(guó)梭子蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量?jī)H10.1萬(wàn)噸，這一產(chǎn)量遠(yuǎn)不能夠滿(mǎn)足消費(fèi)者需求。苗種短缺是制約梭子蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量的重要原因。因此，分子育種在三疣梭子蟹苗種繁育工作中發(fā)揮著重要作用。

CRISPR/Cas9技術(shù)是近幾年出現(xiàn)的用于基因編輯的技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)在DNA水平，對(duì)DNA序列進(jìn)行刪除或插入。但在三疣梭子蟹分子育種中，這一技術(shù)并沒(méi)有得到很好的實(shí)施。因此，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在三疣梭子蟹中的開(kāi)展，一方面有助于三疣梭子蟹基因功能的研究，另一方面有助于研制三疣梭子蟹新品系，為三疣梭子蟹良種培育奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種靶向三疣梭子蟹dmy基因的SgRNA及三疣梭子蟹基因編輯的方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)三疣梭子蟹受精卵進(jìn)行基因編輯，進(jìn)而為三疣梭子蟹突變品系的培育奠定基礎(chǔ)。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種三疣梭子蟹基因編輯的方法，包括如下步驟：

（1）根據(jù)三疣梭子蟹基因設(shè)計(jì)合成SgRNA的靶點(diǎn)，再根據(jù)所述SgRNA的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成引物，利用所述引物將所述三疣梭子蟹基因與質(zhì)粒連接，純化回收后得到SgRNA；

（2）對(duì)Cas9質(zhì)粒進(jìn)行線(xiàn)性化酶切處理后，純化，體外轉(zhuǎn)錄得到 Cas9?mRNA；

（3）將步驟（1）的SgRNA和步驟（2）的 Cas9?mRNA稀釋后混合成注射液；

（4）提前制備三疣梭子蟹受精卵的顯微注射模具，并利用模具制備瓊脂糖凹槽；

（5）獲取三疣梭子蟹受精卵置于所述瓊脂糖凹槽中，將步驟（3）中的注射液注入受精卵中，靜置后，低速海水培養(yǎng)并維護(hù)，得到三疣梭子蟹胚胎；

（6）提取三疣梭子蟹胚胎的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增克隆后，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒定胚胎的突變類(lèi)型，得到經(jīng)過(guò)基因編輯的三疣梭子蟹胚胎。

進(jìn)一步的，所述步驟（1）中的引物的核苷酸序列如下：

F1：TGTAATACGACTCACTATAgagcaaaatgtcaccagtggGTTTTAGAGCTAGAAAT；R1：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC。