[發明專利]一種基于滾環與雜交鏈式反應檢測外泌體的生物傳感器

有效

• 申請號: 202111470579.4
• 申請日: 2021-12-03
• 公開（公告）號: CN114561463B
• 公開（公告）日: 2023-07-28
• 發明（設計）人: 王玉;朱鏡儒;黃加棟;劉素;郭志強;李倩茹;姚玉穎;李宗強;李靜靜;張清心;徐婉晴;朱志學
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6816;C12Q1/6825;G01N21/64;C12N15/11;C12N15/115
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 牛芳

本發明屬于傳感器技術領域，提供了基于滾環與雜交鏈式反應檢測外泌體的生物傳感器，包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1?5所示的CT模板，引物P，發夾探針H1、H2、H3，T4連接酶，phi29?DNA聚合酶，dNTP和NMM。本發明通過對外泌體特異蛋白的識別，通過滾環和雜交鏈式反應實現目標循環放大，利用適配體的特異性和專一性來實現對目標物的靈敏檢測的生物傳感器，該傳感器具有檢測速度快、操作簡單、特異性高等優點。

技術領域

本發明屬于傳感器技術領域，涉及一種檢測外泌體的生物傳感器。

背景技術

外泌體是一種由細胞分泌的膜性囊泡小體，直徑通常為30-100?nm，密度為1.10-1.18?Kg/L。外泌體廣泛存在于各種體液中，可攜帶脂類、蛋白質、信使RNAs、非編碼RNAs等多種重要的生物功能分子，能夠參與細胞間物質交換和信息交流。外泌體中所含有的與腫瘤相關的蛋白，核酸，小分子等，都有潛力成為潛在的生物標志物。腫瘤細胞分泌的外泌體的含量在血液中的含量很高，每毫升血液中含有超過10⁹個外泌體，以利用外泌體作為生物標志物進行檢測會有更高的靈敏度，有助于癌癥的早期檢測。

近年來，外泌體已經成為一些最有前景的疾病診斷生物標志物，特別是外泌體膜蛋白水平與癌癥密切相關，從而為癌癥的診斷和預后提供了一種新思路。目前現有的方法包括Western?blot和酶聯免疫試驗（ELISA）都可以檢測外泌體，但這些方法處理過程繁瑣且依賴昂貴儀器以及整個流程時間過長而無法在臨床上應用。因此現在急需一種快速、準確、簡便的分析方法對外泌體進行檢測。近幾年，生物傳感領域快速發展，由于其靈敏性和特異性收到廣泛關注，光學生物傳感器便為其中有效檢測手段。

發明內容

為了實現更加快速、低成本的檢測外泌體，本發明提供了一種化學發光檢測外泌體的生物傳感器，特異性和靈敏度高、成本低、檢測速度快。

一種基于滾環與雜交鏈式反應檢測外泌體的生物傳感器，包括核苷酸序列如SEQID?NO:?1-5所示的CT模板，引物P，發夾探針H1、H2、H3，T4連接酶，phi29?DNA聚合酶，dNTP和NMM（N-甲基卟啉二丙酸IX）。

優選地，所述模板探針TP和連接探針LP由成環的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:?1所述的環狀模板代替，且不含T4連接酶。

更優選地，所述環狀模板的制備方法如下：

將CT模板和引物P在緩沖溶液中于95℃下孵育5min，冷卻至室溫后，加入T4連接酶，16℃下孵育過夜，然后在65℃下10min滅活酶，獲得環狀模板。

優選地，所述傳感器中還包括外泌體標準品。

上述生物傳感器可用于制備檢測外泌體試劑盒。

上述生物傳感器或試劑盒在檢測外泌體中的應用。

具體地，上述應用包括以下步驟：

（1）CT模板和引物P制備環狀模板；

（2）將環狀模板、phi29?DNA聚合酶，dNTP，發夾探針H1、H2、H3，NMM分別加入到緩沖溶液中，再加入含外泌體的溶液，混勻后于37℃下孵育，獲得反應液；

（3）反應液進行熒光檢測。

優選地，步驟（2）中還包括制備外泌體標準曲線的步驟。

優選地，步驟（3）中熒光檢測的激發波長為610nm，檢測波長為590?nm-650?nm。

本發明的檢測原理如下：

本發明的傳感器在對外泌體進行檢測時用到以下序列：