[發明專利]Akt1磷酸化PMS2蛋白在作為卵巢癌治療靶點中的應用

在審

• 申請號: 202111465491.3
• 申請日: 2021-12-01
• 公開（公告）號: CN114150062A
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發明（設計）人: 高芳芳
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第三附屬醫院（河南省婦幼保健院）
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/02;G01N33/574;G01N33/68
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 王峰剛

本發明屬于生物技術領域，公開了一種Akt1磷酸化PMS2蛋白在作為卵巢癌治療靶點中的應用，所述鑒定Akt1磷酸化PMS2蛋白作為卵巢癌治療靶點的方法包括：通過Western Blot檢測活化Akt1和p?PMS2關系；檢測p?PMS2 T156下調后卵巢癌細胞遷移能力的變化；檢測p?PMS2 T156下調后卵巢癌細胞侵襲能力的變化；通過平板克隆法檢測轉染PMS2?T156A后卵巢癌細胞克隆形成能力的變化；通過流式細胞儀及Western Blot檢測轉染PMS2?T156A卵巢癌細胞凋亡的影響。本發明首次證實Akt1磷酸化PMS2 156位點的蘇氨酸，為卵巢癌研究和治療提供一個新的方向及靶點。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種Akt1磷酸化PMS2蛋白在作為卵 巢癌治療靶點中的應用。

背景技術

目前，卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，其中上皮性卵巢癌約占 85～90％。由于其早期臨床癥狀不明顯，且缺少早期診斷方法，大多數確診時已 屬晚期。據報道2014年，美國新發卵巢癌病例為21980例，死亡病例為14270 例，約2/3的新發病例發現時已是FIGOIII-IV，即已有骨盆外轉移。目前卵巢癌 臨床治療金標準是腫瘤細胞減滅術聯合以鉑為基礎的化療治療，盡管大多數患 者初次治療時對化療反應好，仍有部分患者短期內復發，5年生存率僅不到30％。 目前，早期診斷困難和化療耐藥是影響卵巢癌治療效果和預后差的主要原因。 因此尋求卵巢癌治療新靶點、提高卵巢癌療效，成為當前研究的熱點。

Akt是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又稱蛋白激酶B(protien kinase B，PKB)， 含3種異構體Akt1，Akt2和Akt3，也稱為PKBα，PKBβ和PKBγ。它們有相同 的結構，但編碼于不同的染色體上并且生物學功能差異很大。其中Akt1分布組 織廣泛且在細胞生長和存活中有重要作用；Akt2主要在肌肉和脂肪組織中高表 達，它的作用主要是通過胰島素調節葡萄糖穩定；Akt3表達僅局限在睪丸和腦 組織中。Akt可通過磷酸化多種底物調節細胞活動如生長、增殖、抗凋亡損傷、 控制DNA損傷應答和基因穩定性、代謝、轉移和腫瘤發生。已發現，Akt異常 與多種腫瘤相關，如乳腺癌，結直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、胰 腺癌、肝細胞癌等。另外，在多種細胞系中發現順鉑作用后Akt活化導致順鉑 耐藥性增加。活化的Akt1可以識別和磷酸化靶蛋白中的共有基序RXRXX(S/T) 發揮相應的生物學下游。

DNA錯配修復(MMR)是從細菌到人類所有物種中一高度保守的維持基因 組穩定性的系統。它的主要功能是在合成DNA時，通過特異性鏈去除錯配堿基 和插入/缺失錯配以確保復制保真性。MMR基因胚系突變可導致Lynch綜合征 (LS)發生，一種常染色體顯性遺傳病，具有發展為其他惡性腫瘤的高風險。 MMR蛋白缺乏可增加個體易癌性，如結腸癌、胃癌、子宮內膜癌、卵巢癌等。 研究發現MMR影響了多種細胞過程，如DNA損傷信號，凋亡，有絲分裂和減 數分裂重組，類別轉換重組，體細胞超突變和三聯體擴張。PMS2是MMR其中 一員，目前研究其失衡與LS，乳腺癌，前列腺癌，鼻咽癌，兒童癌癥綜合征， 血液系統腫瘤等多種癌癥的發生有關。但現有技術中關于驗證Akt1磷酸化PMS2 蛋白能否作為卵巢癌治療靶點的技術方案尚未見報導。

通過上述分析，現有技術存在的問題及缺陷為：現有技術中關于驗證Akt1 磷酸化PMS2蛋白能否作為卵巢癌治療靶點的技術方案尚未見報導。

解決以上問題及缺陷的難度為：前期研究發現卵巢癌中PMS2的表達與磷 酸化GSK-3β(p-GSK-3β)呈負相關，免疫共沉淀發現GSK-3β和PMS2能 夠相互結合，提示GSK-3β可通過磷酸化PMS2影響其穩定性，但受限于PMS2 磷酸化位點不清楚，國內外沒有廠商進行相關研究及相關磷酸化位點的抗體制 備，導致不能進一步證實其確切的作用機制。通過軟件發現，PMS2上存在Akt1 磷酸化的共有基序RXRXX(S/T)，并且發現活化的Akt1(p-Akt S473)與PMS2 蛋白表達呈負相關，且CO-IP發現兩者可以直接結合，斷定其存在相互作用位 點，結合蛋白結構學，最終選擇了PMS2156蘇氨酸位點，需要后續大量實驗驗 證。