[發明專利]一種頭孢噻呋的檢測方法及其應用

在審

• 申請號: 202111454767.8
• 申請日: 2021-12-02
• 公開（公告）號: CN114113399A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 楊瑩瑩;孟小賓;張玉良;劉夢月;王倩;劉愛玲;李亞玲;尹相吉;李守軍;張鈺潔;聶麗娜
• 申請（專利權）人: 天津瑞普生物技術股份有限公司;瑞普（天津）生物藥業有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 天津市尚文知識產權代理有限公司 12222
• 代理人: 黃靜

本發明提供了一種檢測血漿中頭孢噻呋的方法。所述血漿中頭孢噻呋的檢測方法是含藥血漿樣品經提取液?二硫赤蘚醇（Dithioerythritol，DTE）溶液水浴提取頭孢噻呋代謝物去呋喃甲酰基頭孢噻呋（DFC），不需要碘乙酰胺溶液衍生化和固相萃取柱處理，提取液經離心制得的上清，再經濾膜過濾后可直接用于高效液相色譜儀檢測。本發明的優點在于：本方法簡化樣品前處理步驟，降低成本，節約時間，試劑使用量少，毒性低，適用于臨床藥代動力學試驗中大批量血漿樣品中頭孢噻呋及其代謝物的快速檢測。

技術領域

本發明屬于生物樣品檢測領域，具體的涉及頭孢噻呋及其代謝物檢測領域，具體的涉及血漿中頭孢噻呋代謝物的檢測。

背景技術

頭孢噻呋（Ceftiofur）別名賽得福，是美國于20世紀80年代開發成功的獸醫專用的第三代頭孢菌素類抗生素，該藥1988年在美國首次上市，由于其優良的抗菌活性和藥動學特征，已陸續被美國、加拿大、日本及歐洲一些國家正式批準用于肉牛、奶牛、馬、豬、羊的呼吸道疾病的治療。頭孢噻呋化學名稱為(6R,7R)-7-[2-(2-氨基噻唑-4-基)(甲氧基亞胺基)乙酰胺基]-3-[(2-呋喃基羰基)硫甲基]-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，分子式C₁₉H₁₇N₅O₇S₃，分子量523.56。頭孢噻呋具有氨基和羧基，故為兩性化合物，其在強酸、強堿及高溫條件下易分解。頭孢噻呋（Ceftiofur）結構式為：

對頭孢噻呋在畜禽體內主要代謝與排泄研究發現，在動物機體內大部分頭孢噻呋快速脫去3位硫代基上的呋喃羧基，轉化成一級代謝物去呋喃甲酰基頭孢噻呋（DesfuroylCeftiofur，DFC）和呋喃甲酸。在血漿、尿液和組織中，DFC通過其3位取代基上的巰基與半胱氨酸、谷光甘肽形成二硫化合物（半胱氨酸-DFC、谷胱甘肽-DFC），此外，DFC還能與血漿蛋白或組織蛋白結合，形成DFC-蛋白復合物。其中，DFC形成蛋白復合物和形成二硫化合物的過程是可逆的，二硫化合物和蛋白結合物可作為DFC在血漿和組織中的儲庫。DFC具有完整的頭孢噻呋有效抗菌基團β-內酰胺環，因此DFC可作為血漿中頭孢噻呋抗菌活性成分進行檢測。去呋喃甲酰基頭孢噻呋（DFC）化學名稱為（6R,7R）-7-[[（2Z）-（2-氨基-4-噻唑基）（甲氧基亞氨基）乙酰基]氨基]-3-（巰基甲基）-8-氧代-5-噻-1-氮雜雙環[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，分子式C₁₄H₁₅N₅O₅S₃，分子量429.5，去呋喃甲酰基頭孢噻呋（DFC）結構式為：

現有血液或組織中頭孢噻呋的檢測方法主要參考《農業部1025號公告-13-2008動物性食品中頭孢噻呋殘留檢測高效液相色譜法》，其檢測原理為組織中殘留的頭孢噻呋與二硫赤蘚醇（DTE）溶液共同培養，使頭孢噻呋及去呋喃甲酰基頭孢噻呋（DFC）有關代謝物從蛋白或含硫化合物中分離，產生DFC。DFC與碘乙酰胺反應，生成穩定的DFC乙酰胺衍生物（DCA），原形藥或代謝物均轉化為DCA衍生物。用C18固相萃取柱對衍生物進行提取。強陰離子交換（SAX）柱純化，再用強陽離子交換（SCX）柱凈化。DCA衍生物用高效液相色譜-紫外法測定。專利CN110412147A公開了一種頭孢噻呋鈉在雞體內的藥代動力學和消除檢測方法，該方法向采集的雞心臟血樣品中加入二硫赤蘚醇（DTE）溶液進行提取，靜置至室溫后加入碘乙酰胺溶液進行衍生處理，磷酸酸化后，離心取上清，經混合型陽離子交換（MCX）柱處理，高效液相色譜法測定DCA含量。

以上對樣品中頭孢噻呋的處理方法，均采用碘乙酰胺溶液衍生化和固相萃取柱處理，存在樣品前處理步驟多，成本高，時間長，樣品前處理所需試劑多，毒性較大等缺點，不適用于臨床藥代動力學試驗中大批量血漿樣品中頭孢噻呋及其代謝物的快速檢測。

發明內容