[發明專利]利用谷氨酸棒狀桿菌高效分泌生產類蛛絲、類彈性蛋白并快速純化的方法

有效

• 申請號: 202111454147.4
• 申請日: 2021-12-01
• 公開（公告）號: CN114149954B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發明（設計）人: 夏小霞;金清;潘芳;錢志剛
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12N15/62;C12R1/15
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

1.一種用于表達分泌重組蛛絲蛋白、類節肢彈性蛋白或類絲節肢彈性蛋白的重組谷氨酸棒狀桿菌的實現方法，其特征在于，分別將信號肽序列和重組蛛絲蛋白、類節肢彈性蛋白或類絲節肢彈性蛋白的編碼基因連接到表達載體自身啟動子序列之后，再將構建的重組表達載體轉化到宿主谷氨酸棒狀桿菌中，得到谷氨酸棒狀桿菌重組菌；

所述的重組蛛絲蛋白包括：具有金絲網蛛(Trichonephila clavipes)蜘蛛牽引絲蛋白單體核心氨基酸序列MaSpI和MaSpII的肽重復8、16、32和64次的蛋白，其中：單體核心氨基酸序列MaSpI和MaSpII如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.根據權利要求1所述的的實現方法，其特征是，所述的類節肢彈性蛋白是指：具有果蠅節肢彈性蛋白Resilin保守肽段氨基酸序列的肽重復16和32次的蛋白，其中：保守肽段氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根據權利要求1所述的的實現方法，其特征是，所述的類絲節肢彈性蛋白是指：具有果蠅節肢彈性蛋白和蠶絲蛋白的共聚物的肽重復5次的蛋白，其中：共聚物的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根據權利要求1所述的的實現方法，其特征是，所述的信號肽序列包括：

①Sec分泌系統信號肽，其序列包括：cg1514、cg2196、cg2518、cg2195、cg2585、cg3186、cg3182、cg1109、cg0413、cg1087、cg1243、cg2868、cg3393、cg0470、cg2394、cg2402、cg0316；

②Tat分泌系統信號肽，其序列包括：cg0955、cg2485、TorA。

5.根據權利要求1～4中任一所述的實現方法，其特征是，具體包括以下步驟：

步驟1)以谷氨酸棒狀桿菌RES167基因組或大腸桿菌MG1655基因組為模板，通過PCR擴增或引物退火合成DNA片段的方法得到信號肽序列；

步驟2)將步驟1得到的信號肽序列分別與表達載體通過酶切位點相連，構建20種信號肽質粒pCG_N；

步驟3)選擇性地將8、16、32、64次重復的重組蛛絲蛋白的編碼基因、16、32次重復的類節肢彈性蛋白的編碼基因或5次重復的類絲節肢彈性蛋白的編碼基因中的任一一種，通過酶切位點與步驟2得到的任意一種信號肽質粒pCG_N連接，得到目的蛋白表達質粒；

步驟4)將步驟3得到的目的蛋白表達質粒電轉至谷氨酸棒狀桿菌中，得到谷氨酸棒狀桿菌重組菌。

6.根據權利要求5所述的的實現方法，其特征是，在信號肽基因氨基端插入一段核糖體識別序列(aaaggaggacacgca)以保證基因在谷氨酸棒狀桿菌中的正確翻譯；并在信號肽序列核苷酸5`端和3`端分別引入酶切位點。

7.一種基于權利要求1～6中任一所述方法得到的用于提高重組蛛絲蛋白表達分泌的基因工程改造的谷氨酸棒狀桿菌，其特征在于，基于谷氨酸棒狀桿菌RES167改造得到；

所述的基因工程改造，包括：基因敲除和過表達。

8.根據權利要求7所述的谷氨酸棒狀桿菌，其特征是，所述的基因工程改造，通過以下任意一種方式實現：

a)敲除核苷酸序列組SEQ ID NO.25-NO.40中的任意一個；

b)同時敲除如SEQ ID NO.25所示的重組酶RecA編碼基因recA和如SEQ ID NO.27所示的青霉素結合蛋白PBP1a編碼基因pbp1a；

c)同時敲除如SEQ ID NO.27所示的青霉素結合蛋白PBP1a編碼基因pbp1a和如SEQ IDNO.26所示的RNA聚合酶σ因子SigD蛋白編碼基因sigD；

d)敲除如SEQ ID NO.27所示的青霉素結合蛋白PBP1a編碼基因pbp1a和如SEQ IDNO.28所示的Ncgl1480基因；

e)過表達如核苷酸序列SEQ ID NO.33-NO.36、SEQ ID NO.41-NO.45所示的基因中的任一一個。