[發明專利]一種血清中pro-SFTPB的定值方法

在審

• 申請號: 202111421732.4
• 申請日: 2021-11-26
• 公開（公告）號: CN114166966A
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發明（設計）人: 高俊順;高俊莉;江南;王洪;宋林珍
• 申請（專利權）人: 杭州廣科安德生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N33/543;G01N33/553;G01N33/68
• 代理公司: 北京知果之信知識產權代理有限公司 11541
• 代理人: 高科

1.一種血清中pro-SFTPB的定值方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)制備抗體包被磁珠：活化磁珠，向活化后的磁珠中加入抗體進行偶聯反應，待反應完畢，分離并清洗磁珠，再加入封閉劑，封閉磁珠上非特異性結合位點，再對磁珠進行分離清洗，并用PBS溶液重懸，得抗體包被磁珠；

(2)向血清樣本中加入抗體包被磁珠，并用PBS進行稀釋，振蕩孵育使血清中的pro-SFTPB結合到磁珠偶聯的抗體上，清洗磁珠除去磁珠上非特異性結合的蛋白；

(3)向步驟(2)所得結合有pro-SFTPB的磁珠樣本中依次加入變性試劑、還原試劑、烷基化試劑與樣本中的pro-SFTPB進行反應；再加入胰蛋白酶溶液進行酶解，得到含有特征肽段SFTPBb的樣本；

(4)向步驟(3)所得含有特征肽段SFTPBb的樣本中加入同位素標記的內標肽段SFTPBb_IS，再經脫鹽柱純化，收集洗脫液；

(5)將步驟(4)所得洗脫液經冷凍干燥后復溶，進行納升液相色譜-質譜分析，通過特征肽段與內標肽段的峰面積比值求得上機樣本中特征肽段的濃度，并根據特征肽段的濃度計算血清樣本中pro-SFTPB的濃度。

2.根據權利要求1所述一種血清中pro-SFTPB的定值方法，其特征在于，步驟(1)中，所述活化磁珠為：在磁珠中依次加入EDC和NHS試劑，在室溫下旋轉孵育30min進行活化；待磁珠活化后，除去EDC和NHS試劑，向活化后的磁珠中加入pro-SFTPB的單克隆抗體，混勻后在室溫下旋轉孵育2h進行偶聯反應，所加pro-SFTPB的單克隆抗體與磁珠的重量比為：30ug:1mg。

3.根據權利要求1所述一種血清中pro-SFTPB的定值方法，其特征在于，步驟(1)中，所述封閉劑為含有1％BSA的PBS緩沖液，加入封閉劑在室溫下旋轉孵育2h，再在4℃下靜置15-24h，封閉磁珠上非特異性結合位點。

4.根據權利要求1所述一種血清中pro-SFTPB的定值方法，其特征在于，步驟(1)中，所述重懸為：向磁珠中加入含0.1％BSA的PBS緩沖液至磁珠的濃度為1-10mg/mL。

5.根據權利要求1所述一種血清中pro-SFTPB的定值方法，其特征在于，步驟(3)中，所述變性試劑為含有5M尿素的50mM碳酸氫銨溶液，在樣本中加入變性試劑后，在室溫2000rpm的條件下振蕩孵育10min；再加入還原試劑500mM的TCEP溶液，混合均勻，在37℃、2000rpm的條件下振蕩孵育60min；再加入烷基化試劑500mM的碘乙酰胺溶液，混合均勻，在室溫避光條件下，2000rpm振蕩孵育60min，再加入胰蛋白酶溶液將變性試劑中尿素的濃度降至1M以下，置于37℃、1500rpm的條件下振蕩孵育24-48h，得含有特征肽段SFTPBb的樣本。

6.根據權利要求5所述一種血清中pro-SFTPB的定值方法，其特征在于，所述特征肽段SFTPBb的序列為：LVLPVLPGALQAR。

7.根據權利要求1所述一種血清中pro-SFTPB的定值方法，其特征在于，步驟(4)中，向含有特征肽段SFTPBb的樣本中依次加入10％甲酸水溶液和同位素標記的內標肽段SFTPBb_IS，混勻后加入預先平衡的脫鹽柱中，先用15％乙腈水溶液清洗2次，再用含0.1％甲酸的90％乙腈水溶液洗脫3次，收集與合并洗脫液。

8.根據權利要求7所述一種血清中pro-SFTPB的定值方法，其特征在于，內標肽段SFTPBb_IS的序列為：LVLPVLPGALQAR*¹³C₆，¹⁵N₄。

9.根據權利要求1所述一種血清中pro-SFTPB的定值方法，其特征在于，步驟(5)中，所述復溶為：用含0.1％甲酸的15％乙腈水溶液進行復溶。

10.根據權利要求1所述一種血清中pro-SFTPB的定值方法，其特征在于，步驟(5)中，血清樣本中pro-SFTPB的濃度C_protein的計算公式為：

C_protein＝C_peptide×V_Dilute×P_UV×M_protein/V_sample×M_peptide

式中：

C_protein表示原始血樣中的蛋白濃度；

C_peptide表示上機樣本中測定的特征肽段濃度；

V_Dilute表示樣本脫鹽干燥后的復溶體積；

P_UV表示測定的特征肽段紫外純度；

M_protein表示測定蛋白的分子量；

V_sample表示原始血清樣本的體積；

M_peptide表示測定的特征肽段分子量。