[發(fā)明專利]β-甘露聚糖酶突變體及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111383550.2
• 申請日: 2021-11-22
• 公開（公告）號: CN113913407B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發(fā)明（設計）人: 王克芬;佟新偉;劉文龍;張杰;王興吉;錢娟娟
• 申請（專利權）人: 山東隆科特酶制劑有限公司
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12P19/14;C12R1/84
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及耐酸耐熱的β?甘露聚糖酶突變體及基因和突變體的制備方法。本發(fā)明對來源于黑曲霉的β?甘露聚糖酶ManA氨基酸序列中第129、258、345和424位點的氨基酸V、W、G和K分別突變?yōu)镮、R、A和R，獲得耐酸、耐熱的β?甘露聚糖酶突變體及其突變基因，同時將含有突變基因的重組表達載體，轉入酵母菌株中，通過甲醇誘導表達，最高酶活水平達到51000U/mL，能進一步降低β?甘露聚糖酶的生產(chǎn)成本，促進β?甘露聚糖酶在飼料食品行業(yè)的廣泛應用，且能積極應對因新冠疫情帶來的原材料價格上漲的困局。

技術領域：

本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及耐酸耐熱的β-甘露聚糖酶突變體及編碼基因和突變體的制備方法。

背景技術：

甘露聚糖是植物半纖維素的主要成分，廣泛存在于自然界中，它是多種植物細胞壁的主要組成成分，作為植物性飼料原料被視為一種抗營養(yǎng)因子。β-甘露聚糖酶在飼料工業(yè)中作為一種飼料添加劑，能有效地降解飼料中的甘露聚糖，提高動物對飼料的消化能力。

目前，β-甘露聚糖酶是我國己經(jīng)批準使用的12種飼料級酶制劑中的一種，并且作為一種高效的飼料添加劑廣泛應用于飼料工業(yè)中。從上個世紀90年代以來，歐美國家90％的家禽飼料中添加酶制劑，60％的豬用口糧中添加酶制劑。我國起步較晚，但其一直是飼料生產(chǎn)和應用研究的重點，β-甘露聚糖酶作為一種重要的飼料用酶，近年來受到了越來越多的重視。

自然界β-甘露聚糖酶主要來源于微生物，包括曲霉屬、青霉屬、木霉屬等絲狀真菌以及芽孢桿菌屬和放線菌屬等細菌。真菌β-甘露聚糖酶作用pH值范圍一般為酸性至中性，細菌甘露聚糖酶多為中性至堿性。

目前飼料添加劑用酶都需要經(jīng)過高溫制粒，制備能夠耐高溫、耐酸、具有對消化酶耐受性提高的β-甘露聚糖酶，對于β-甘露聚糖酶在飼用酶和工業(yè)化應用具有重要價值。

野生型的β-甘露聚糖酶基因經(jīng)過異源表達和理性設計后能夠獲得較好的酶學性質，對于提高現(xiàn)有的β-甘露聚糖酶的耐高溫性能發(fā)揮著至關重要的作用。畢赤酵母表達系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展成為一個成熟的外源蛋白表達系統(tǒng)，工業(yè)上常用來大規(guī)模表達外源蛋白。

發(fā)明內容：

本發(fā)明的主要目的是提供一種β-甘露聚糖酶突變體及其基因、及含有該基因的重組表達載體和重組菌株、及該重組菌制備β-甘露聚糖酶的方法，旨在解決現(xiàn)有技術中β-甘露聚糖酶耐酸、耐高溫性差的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過將來源于黑曲霉(Aspergillus?niger)CGMCCNo.10788的甘露聚糖酶ManA氨基酸序列中第129、258、345和424位點的氨基酸V、W、G和K分別突變?yōu)镮、R、A和R，獲得耐酸、耐熱的β-甘露聚糖酶突變體，所述突變體具有序列表SEQ?IDNO.3所示的氨基酸序列。

本發(fā)明還提供上述突變體的編碼基因；

進一步地，所述編碼基因具有序列表SEQ?ID?NO.4所述的核苷酸序列。

本申請還提供一種重組表達載體，包含上述的β-甘露聚糖酶突變編碼基因；

優(yōu)選地，所述重組表達載體的表達載體為pPIC9。

本申請還提供一種重組菌株，包含上述的β-甘露聚糖酶突變編碼基因或重組表達載體；

優(yōu)選的，所述菌株的宿主細胞為畢赤酵母；

本申請還提供上述重組表達載體或重組菌株的應用，特別是在制備β-甘露聚糖酶中的應用；

進一步地，采用上述重組菌株制備β-甘露聚糖酶的方法如下：