[發明專利]表達3型鴨甲型肝炎病毒P1和3C基因的重組鴨瘟病毒及其構建方法和用途

有效

• 申請號: 202111370551.3
• 申請日: 2021-11-18
• 公開（公告）號: CN114196639B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發明（設計）人: 李凱;高玉龍;王笑梅;高立
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所(中國動物衛生與流行病學中心哈爾濱分中心)
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/62;C12N15/85;A61K39/295;A61K39/245;A61K39/125;A61P31/14;A61P31/22
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

1.表達3型鴨甲型肝炎病毒(Duck?Hepatitis?A?Virus?3，DHAV3)P1和3C基因的重組鴨瘟病毒(Duckentertisvirus，DEV)，其特征在于，所述的重組鴨瘟病毒是在鴨瘟病毒基因組US7、US8基因之間的間隔區插入包含β-actin啟動子、3型鴨甲型肝炎病毒P1和3C基因的表達框架β-actin-P13C后得到的；其中，所述的鴨瘟病毒為鴨瘟病毒弱毒疫苗C-KCE株，所述的3型鴨甲型肝炎病毒P1和3C基因表達框架β-actin-P13C的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種構建權利要求1所述的重組鴨瘟病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)表達DHAV3?P1和3C基因的重組質粒構建

通過PCR方法擴增得到3型鴨甲型肝炎病毒的P13C基因片段，將擴增獲得的P13C基因片段經EcoR1、ClaI酶切后，插入經同樣酶切處理的pCAGGS載體，獲得共同表達DHAV3?P1和3C基因的重組真核表達質粒pCAGGS-P13C；

(2)表達DHAV3?P1和3C基因的入門質粒構建

將上述構建的pCAGGS-P13C表達質粒用SalI和BamHI進行酶切，酶切產物回收后獲得P13C基因表達框架β-actin-P1-3C，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；將獲得的表達框架β-actin-P13C通過SalI和BamHI酶切位點克隆入pENTR1入門載體，獲得表達DHAV3?P1和3C基因的入門質粒pENTR1-P13C；

(3)表達DHAV3?P1和3C基因的重組粘粒構建

將Kan-ccdB表達框架插入含有DEV弱毒疫苗C-KCE株基因組DNA片段的重組粘粒C343的US7和US8基因之間，獲得重組突變粘粒C343-US78-KanccdB；將入門質粒pENTR1-P13C與重組突變粘粒C343-US78-KanccdB混合并進行LR反應，使β-actin-P13C表達框架替換Kan-ccdB表達框架，獲得在重組粘粒C343的US7、US8基因之間插入β-actin-P13C表達框架的重組粘粒C343-US78-P13C；

(4)表達DHAV3?P1和3C基因的重組DEV的拯救

提取含有DEV基因組DNA片段的重組粘粒C027、C018、C144、C211以及含有P13C表達框架的重組粘粒C343-US78-P13C，通過磷酸鈣轉染方法將五個粘粒共轉染CEF細胞，轉染4-5天后可觀察到細胞病變的出現，拯救出的重組病毒命名為rDEV-US78-P13C，即為表達3型鴨甲型肝炎病毒P1和3C基因的重組鴨瘟病毒；

其中，所述的重組粘粒C343、C027、C018、C144、C211為分別包含DEV弱毒疫苗C-KCE株基因組DNA片段并可拼接覆蓋完整DEV基因組的五個pCC1Fos粘粒，其中，C027包含C-KCE株基因組1-40133位的核苷酸片段、C018包含C-KCE株基因組28323-67264位的核苷酸片段、C144包含C-KCE株基因組59085-98008位的核苷酸片段、C211包含C-KCE株基因組81629-67264位的核苷酸片段、C343包含C-KCE株基因組113857-158014位的核苷酸片段。

3.權利要求1所述的重組鴨瘟病毒在制備預防鴨病毒性肝炎和鴨瘟藥物中的用途。

4.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的藥物為疫苗。