[發明專利]一種養殖水體中真菌毒素的檢測方法

有效

• 申請號: 202111346157.6
• 申請日: 2021-11-15
• 公開（公告）號: CN114062571B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: 陳猛;馬曉霞;李斌;王倩
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/02
• 代理公司: 廈門致群財富專利代理事務所(普通合伙) 35224
• 代理人: 劉兆慶

1.一種養殖水體中真菌毒素的檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)樣品前處理

將HLB柱依次用甲醇和超純水進行活化，得到活性HLB柱；將待測水樣經0.4～0.6μm濾膜過濾之后加入Na₂EDTA和同位素替代物，然后以4～6mL/min的流速通過活性HLB柱進行上樣，所述活性HLB柱中填料干重和柱內體積與待測水樣的比例為1g:(12～24mL):(1.0～2.0L)；上樣結束后，將HLB柱用超純水淋洗，再用隔膜真空泵抽干，之后用甲醇、甲酸和二氯甲烷的混合溶劑作為洗脫溶劑進行洗脫，所得洗脫液在35～45℃下氮吹至干，再加入磺胺噻唑-D₄作為內標物，用甲醇、甲酸和水的混合溶液定容，最后經0.1～0.3μm濾膜過濾得到待測樣品溶液，待LC-MS/MS檢測；

(2)配制標準溶液

將真菌毒素標準品、同位素替代物和磺胺噻唑-D₄分別用溶劑稀釋并最終配制成具有0.05～100ng/mL濃度梯度的真菌毒素標準品溶液、同位素替代物溶液和磺胺噻唑-D₄溶液；

(3)樣品檢測

將真菌毒素標準品溶液、同位素替代物溶液和磺胺噻唑-D₄溶液進行LC-MS/MS測定，得到標準工作曲線；將待測樣品溶液進行LC-MS/MS測定，采用內標法定量，并將所得檢測曲線與標準工作曲線進行比對，得到待測水樣中各待測成分的含量；

步驟(1)中，所述混合溶劑中甲醇、甲酸和二氯甲烷的體積比為(11～13):(0.005～0.01):8；

步驟(1)和步驟(2)中，所述同位素替代物同時含有AFB1-¹³C₁₇、AFG2-¹³C₁₇、DON-¹³C₁₅、HT-2-¹³C₂₂和OTA-¹³C₂₀；

步驟(2)中，所述真菌毒素標準品同時含有串珠鐮刀菌素、二乙酰鑣草鐮刀菌烯醇、HT-2毒素、新茄病鐮刀菌烯醇、T-2毒素、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧瓜萎鐮菌醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、伏馬毒素B3、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素M2、雜色曲霉素、赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B；

所述LC-MS/MS測定過程中液相色譜條件包括：色譜柱為菲羅門五氟苯基柱Titank F5，柱溫為30℃，流速為0.25mL/min，進樣量為5μL，流動相以含0.1％v/v甲酸的超純水作為A相且以含0.1％v/v甲酸的甲醇作為B相，采用梯度洗脫且梯度洗脫程序如下：0～2min的流動相為85％A相和15％B相的混合溶液，4～6min的流動相為55％A相和45％B相的混合溶液，8～14min的流動相為40％A相和60％B相的混合溶液，19～23min的流動相為30％A相和70％B相的混合溶液，25～30min的流動相為10％A相和90％B相的混合溶液，30.01～40min的流動相為85％A相和15％B相的混合溶液。

2.根據權利要求1所述的養殖水體中真菌毒素的檢測方法，其特征在于，步驟(1)中，相對于1L待測水樣，所述Na₂EDTA的用量為0.5～1g。

3.根據權利要求1所述的養殖水體中真菌毒素的檢測方法，其特征在于，步驟(1)中，所述混合溶劑為6mL甲醇、6mL含0.1％v/v甲酸的甲醇和8mL二氯甲烷的混合液。

4.根據權利要求1所述的養殖水體中真菌毒素的檢測方法，其特征在于，步驟(1)中，所述混合溶液中甲醇、甲酸和水的體積比為(18～20):(0.01～0.05):(75～85)。

5.根據權利要求4所述的養殖水體中真菌毒素的檢測方法，其特征在于，步驟(1)中，所述混合溶液為含0.1％v/v甲酸的甲醇溶液與水按照體積比2:8配成的混合液。

6.根據權利要求1所述的養殖水體中真菌毒素的檢測方法，其特征在于，所述LC-MS/MS測定過程中質譜條件包括：采用Agilent6490串聯質譜儀，電噴霧離子源，多反應離子選擇監測模式；鞘氣溫度為400℃，流速為12L/min；干燥氣溫度為300℃，流速為10L/min；霧化壓力為35psi；噴嘴電壓為1500V；毛細管電壓為4000V；破碎電壓為380V；四級桿溫度為100℃；碰撞氣為高純氮氣。