[發明專利]一種表達PCV2d cap蛋白的載體及方法

在審

• 申請號: 202111329159.4
• 申請日: 2021-11-10
• 公開（公告）號: CN114058646A
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 湯細彪;黃超;黃英;楊柳;宋文博;龍云志;劉錦錦;李倩倩;梁鞏;余道兵;周明光;徐高原
• 申請（專利權）人: 武漢科前生物股份有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/67;C12N15/34;C12P21/02;C07K14/01;C07K1/18;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 武漢高得專利代理事務所(普通合伙) 42268
• 代理人: 姜璐

本發明公開了一種表達PCV2d cap蛋白的載體及方法，使用Bac?to?Bac桿狀病毒表達系統，通過對pFast Bac Dual載體進行改造，使用SV40啟動子順式作用元件、增加AcMNPV基因中同源重復序列(Hr1)、增加轉錄后調控元件(WPRE)改造pFast Bac Dual載體，PCV2d cap蛋白編碼基因與pFast Bac Dual載體連接，將所得轉移質粒轉化DH10Bac大腸桿菌，通過轉座重組，獲得重組桿狀病毒質粒，采用Sf9細胞培養和重組桿狀病毒增殖，來提高PCV2cap重組蛋白的表達量。對Bac?to?Bac桿狀病毒表達系統表達的目的蛋白濃度進一步提高，有助于提高制備PCV2d的抗原、抗體、或亞單位疫苗的生產效率和降低生產成本。

技術領域

本發明屬于桿狀病毒表達載體系統技術領域，具體涉及一種表達PCV2d cap蛋白的載體及方法。

背景技術

1993年出現了Bacmid技術，Bacmid是組裝有桿狀病毒DNA的細菌人工染色體(Bacterial artificial chromosomes,BACs)，因此Bacmid可以維持于大腸桿菌細胞內并在大腸桿菌中增殖，Bac-to Bac具有“Bacteria”到“Baculovirus”之意。桿狀病毒表達載體系統包含3個部分:轉移質粒、桿狀病毒表達載體和昆蟲細胞。轉移質粒由Ph或P10啟動子、啟動子下游的多克隆位點、polyA序列、需要可在外源基因N端加入GP64、蜂毒素或幾丁質酶等信號肽促使蛋白分泌表達，在開放閱讀框N端或C端加入6x組氨酸標簽利于蛋白純化，TEV酶切位點可用于后期組氨酸標簽的移除。感受態大腸桿菌DH10Bac中包含兩個質粒:穿梭質粒和輔助質粒。穿梭質粒(Bacmid)具有在細菌中低拷貝mini-F復制子、mini-attTn7轉座位點、卡納霉素抗性基因的桿狀病毒基因組，不含有桿狀病毒多角體蛋白；輔助質粒編碼轉座酶，可維持在大腸桿菌中，使轉移質粒上的表達盒通過轉座作用定向轉移到桿狀病毒表達載體上，含有四環素抗性基因。

轉移質粒轉化到感受態細胞中后，在轉座酶催化作用下，將Tn7轉座子左右臂定向轉移到Bacmid的Tn7位點，形成具有外源基因的Bacmid。轉移載體中攜帶有LacZ基因，其產生的a-肽與宿主菌的a-肽互補可編碼β半乳糖苷酶，經過IPTG誘導分解底物X-gal形成藍色噬菌斑。當外源基因插入到轉移載體中LacZ的多克隆位點，導致LacZ失活，破壞了a.-肽的互補形成，在含有X-gaL和IPTG的平板中生長白色噬菌斑。因此重組質粒可在相應抗性、IPTG和X-gal(或Bluo-gal)底物的瓊脂糖平板上通過藍白斑篩選獲得，然后經過堿裂解方法獲得病毒DNA，純化的桿粒DNA用于轉染昆蟲細胞，生產具有感染性的BV。

第二代商品化BEVS為Invitrogen公司生產的Bac-to-BacTM該表達系統，桿狀病毒表達載體優勢:(i)昆蟲細胞是真核細胞，具有完備的翻譯后加工修飾功能，重組蛋白與天然蛋白具有相似的生物活性；(ii)外源基因容量大，桿狀病毒表達載體大小約為134kbp,適合較大的基因克隆和同時多個基因的克隆；(iii)生物安全性好，桿狀病毒不感染包括人在內的哺乳動物；(iv)在強啟動子Ph或P10的調控下，重組蛋白具有很高的表達水平。該系統生產的桿狀病毒不需要蝕斑純化過程，然而，需要通過抗性基因從親代病毒DNA中篩選重組病毒DNA，含有重組病毒DNA的細菌增殖過程以及重組病毒DNA的抽提純化過程，均可能會影響桿狀病毒粒子的穩定性，甚至導致重組病毒表達丟失。