[發(fā)明專利]一種凋亡微囊泡及其制備方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111282900.6
• 申請日: 2021-11-01
• 公開（公告）號: CN113943705B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發(fā)明（設計）人: 周永勝;張曉;劉云松;朱原
• 申請（專利權）人: 北京大學口腔醫(yī)學院
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786;A61L27/38;A61L27/50
• 代理公司: 北京知匯林知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11794
• 代理人: 董濤

本發(fā)明提供一種凋亡微囊泡的制備方法，包括：1)體外培養(yǎng)小鼠單核巨噬細胞白血病細胞系；2)細胞匯合度達到90?100％時，加入星形孢菌素(staurosporine，STS)誘導細胞凋亡；3)收集培養(yǎng)液上清液，然后通過梯度離心法分離即得到凋亡微囊泡(apoptotic?vesicle，apoVs)。本發(fā)明還提供了該凋亡微囊泡及其在制備用于促進間充質(zhì)干細胞成脂分化的制劑中的應用。本發(fā)明提供的凋亡微囊泡能夠促進間充質(zhì)干細胞成脂向分化，可以用于軟組織缺損或凹陷的修復，且無明顯副作用。

技術領域

本發(fā)明涉及生物組織工程技術領域，具體涉及一種可用于促進間充質(zhì)干細胞成脂分化的凋亡微囊泡及其制備方法和應用。

背景技術

外傷、感染、手術或先天畸形導致的軟組織缺損或凹陷在臨床中十分常見。頜面部軟組織缺損有先天性因素和后天性因素兩大類，先天性因素最常見的是唇腭裂，后天性因素主要有外傷導致的，如交通事故、燒傷，還有感染性疾病和腫瘤占位也會導致軟組織缺損。此外，乳腺良惡性病變術后乳房變形、缺如也是常見的軟組織缺損類型。組織重建是頜面部及乳房的術后修復的重要部分。除上述軟組織缺損之外，隨著年齡的增長，人們會出現(xiàn)面部老態(tài)的問題，比如皺紋、面部凹陷或皮膚松弛等，都是比較常見的問題，隨著人們生活水平的提高和對美的追求，如何安全有效進行面部年輕化治療也是臨床研究的熱點。

自體脂肪填充、人工合成或生物性填充材料植入是軟組織缺損修復和凹陷修復的常用方法。但是，自體脂肪填充可能會導致術后高吸收率、液化壞死以及供區(qū)瘢痕攣縮等情況。人工合成填充物往往會導致機體產(chǎn)生免疫排斥反應，而生物型填充材料降解快、易吸收，需要多次填充。因此，研發(fā)更安全、有效的脂肪再生手段極為重要。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有軟組織缺損修復和凹陷修復治療方法存在較多副作用和不足之處，本發(fā)明提供了一種安全高效促進脂肪再生的細胞外囊泡，旨在解決現(xiàn)有軟組織缺損修復和凹陷修復治療中因產(chǎn)生副作用而限制了其治療應用的問題。

脂肪再生是指通過模擬脂肪組織發(fā)生發(fā)育的過程，從而在特定區(qū)域形成新生的脂肪組織，恢復軟組織結構和功能，同時避免出現(xiàn)相關并發(fā)癥。利用組織工程進行軟組織缺損修復，可以避免填充材料植入引起的免疫排斥反應，且無需自體供區(qū)組織，就可以實現(xiàn)軟組織再生，減少了供區(qū)創(chuàng)傷。

本發(fā)明提供了一種用于軟組織修復的凋亡微囊泡的制備方法，包括：

1)體外培養(yǎng)小鼠單核巨噬細胞白血病細胞系；

2)細胞匯合度達到90-100％時，加入星形孢菌素(staurosporine，STS)誘導細胞凋亡；

3)收集培養(yǎng)液上清液，然后通過梯度離心法分離即得到凋亡微囊泡。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，

步驟1)中所述小鼠單核巨噬細胞白血病細胞系為RAW264.7；

優(yōu)選地，體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：含有10％FBS和1％青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，所述STS添加量為500nM。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，所述梯度離心法是通過包括下述步驟的方法實現(xiàn)的：

a)將所述培養(yǎng)液上清液于4℃，以800g離心10min，取上清液，獲得第一離心上清液；

b)將所述第一離心上清液于4℃、以2000g離心10min，取上清液，獲得第二離心上清液；

c)將所述第二離心上清液于4℃、以16000g離心30min，取沉淀物，即得粗制凋亡微囊泡。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，所述梯度離心法還包括：