[發明專利]一種酶活提高的丙氨酸-乙醛酸轉氨酶突變體及應用

有效

• 申請號: 202111277497.8
• 申請日: 2021-10-29
• 公開（公告）號: CN113846071B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 王智文;洪坤強;陳濤
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

本發明公開一種酶活提高的丙氨酸?乙醛酸轉氨酶突變體及應用，出發核酸序列為SEQ ID NO.1和氨基酸序列為SEQ ID NO.2的丙氨酸?乙醛酸轉氨酶的第20位異亮氨酸，124位組氨酸，142甘氨酸，196,201天冬氨酸，231色氨酸，256天冬酰胺，341為天冬酰胺，360位精氨酸，391位賴氨酸分別突變為蘇氨酸，精氨酸，色氨酸，酪氨酸，甘氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，甘氨酸，半胱氨酸，谷氨酸；第84位半胱氨酸、207位絲氨酸、217位蘇氨酸、293位賴氨酸發生同義突到核酸序列為SEQ ID NO.3編碼突變氨基酸序列為SEQ ID NO.4的丙氨酸?乙醛酸轉氨酶。用于提高5?ALA產量。

技術領域

一種酶活提高的丙氨酸-乙醛酸轉氨酶突變體及應用，屬于基因工程與應用和微生物技術領域。

背景技術

氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)作為一種重要的高附加值生物基化工產品，廣泛應用于醫藥，農業，飼料等領域。目前，5-ALA的合成主要時化學合成法生產，但是化學合成方法成本高、污染重，限制了其在各領域的推廣應用。隨著生物技術的不斷發展，通過構建微生物細胞工廠來發酵法合成5-ALA具有低成本和無污染的優勢而逐漸成為研究的熱點。生物體內合成5-ALA主要有兩種途徑，分別為C4途徑和C5途徑。其中C4途徑以琥珀酰輔酶A和甘氨酸為底物，經過5-ALA合成酶催化直接合成5-ALA；而C5途徑以谷氨酸為底物，通過三步催化反應得到5-ALA。相比于C5途徑的多步酶催化反應，C4途徑只涉及一步酶促反應，具有明顯優勢。雖然C4途徑中的底物琥珀酰輔酶A為TCA循環中間代謝物可以通過途徑改造實現自我供給，但胞內甘氨酸合成通量不足，而且甘氨酸合成途徑中關鍵酶的酶活力不高，現有利用C4途徑合成5-ALA的菌株和工藝中通常需要外源添加甘氨酸，以保證5-ALA的過量合成和積累。

目前，研究者已經實現在多種宿主中合成5-ALA，例如，莢膜紅球菌，大腸桿菌，谷氨酸棒狀桿菌，枯草芽孢桿菌以及釀酒酵母等等。其中細菌體內的甘氨酸供給主要通過絲氨酸合成代謝途徑產生，并伴隨1碳單位的代謝。有研究者試圖利用該途徑，通過對5-ALA合成菌株代謝工程改造達到甘氨酸胞內合成和供給的目的。例如Ding等在利用C4途徑合成5-ALA的工程菌株中表達解除絲氨酸反饋抑制的SerA實現甘氨酸的胞內供給，但5-ALA產量只比對照菌株提升14％(Ding et al.J Ind Microbiol Biotechnol,2017,44(8):1127-1135)；Zou等在谷氨酸棒狀桿菌中打通絲氨酸合成(serABC)途徑，5-ALA產量提高70％，進一步強化絲氨酸轉化為甘氨酸的酶(glyA)，5-ALA產量提高150％，達到了590mg/L(Zou etal.Biotechnology Letters,2017,39(9):1369)；此外，甘氨酸也可通過乙醛酸途徑產生，例如，ren等在大腸桿菌中引入外源基因aceA和agxT,構建了乙醛酸途徑積累了521mg/L 5-ALA，相比對照菌株提升了38％(Ren et al.ACS Synth biol.2018.7.2750-2757)。

雖然上述工作已經取得一定成效，但絲氨酸合成途徑提供甘氨酸合成的代謝路徑較長，反應步驟較多，已有乙醛酸途徑合成甘氨酸的酶活較低。以上基因工程操作能夠增加工程菌株積累5-ALA，但其最終的產量依然很低，無法滿足工業化規模的生產應用。

本領域仍需要酶活更高的酶來催化合成甘氨酸，進一步優化構建合成5-ALA工程菌株，從而能夠實現高效率、低成本合成5-ALA。

發明內容

本發明提供了一種酶活提高的丙氨酸-乙醛酸轉氨酶突變體及其應用。

技術方案如下：

一種酶活提高的丙氨酸-乙醛酸轉氨酶突變體；突變是核酸序列為SEQ ID NO.3和編碼突變氨基酸序列為SEQ ID NO.4的丙氨酸-乙醛酸轉氨酶突變體。