[發(fā)明專利]黏膜適用的類無針注射效果的外泌體制劑及制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202111215211.3 | 申請日： | 2021-10-19 |
| 公開（公告）號： | CN113730361B | 公開（公告）日： | 2023-06-23 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王哲;明磊國;王清霞;董玲娟;姜勃;白天君 | 申請（專利權(quán)）人： | 陜西科美致尚生物科技有限公司 |
| 主分類號： | A61K9/19 | 分類號： | A61K9/19;A61K35/28;A61K47/10;A61K47/26;A61P15/02;A61P31/02;C12N1/20;C12N5/0775;C12N11/10;A61K9/127;A61K9/14;A61K38/19;A61K45/06;A61K31/722 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 黏膜 適用 類無針 注射 效果 體制 制備 方法 | ||
1.一種黏膜適用的類無針注射效果的外泌體制劑的制備方法，其特征在于，包括：
步驟1，干細胞與乳酸菌共培養(yǎng)：
以海藻酸鈉溶液、CaCl2溶液和乳酸菌為原料，制備乳酸菌-海藻酸鈉凝膠球；將間充質(zhì)干細胞與乳酸菌-海藻酸鈉凝膠球共培養(yǎng)1-3d，分別收集上清液和共培養(yǎng)所得乳酸菌-海藻酸鈉凝膠球；
步驟2，分離外泌體與細胞因子：
步驟1收集的上清液離心去除死細胞，再過濾去除細胞碎片及其它較大粒徑的顆粒，最后通過超濾濃縮工藝根據(jù)分子量依次分離間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體和細胞因子；
步驟3，制備S層蛋白包被的細胞因子脂質(zhì)體：
將步驟2分離得到的細胞因子復(fù)配藥物，所得混合溶液注入攪拌狀態(tài)下的液體磷脂中，然后進行均質(zhì)處理，得到細胞因子脂質(zhì)體溶液；
用檸檬酸鈉處理步驟1共培養(yǎng)所得乳酸菌-海藻酸鈉凝膠球，釋放乳酸菌，擴大培養(yǎng)后收集的乳酸菌經(jīng)氯化鋰處理，收集菌體表面的S層蛋白，制得S層蛋白濃縮液；將S層蛋白濃縮液稀釋后與細胞因子脂質(zhì)體溶液混合均勻，混合液于低溫靜置，得到S層蛋白包被的細胞因子脂質(zhì)體；
步驟4，制備外泌體-脂質(zhì)體凍干粉：
將步驟2所得外泌體和步驟3所得S層蛋白包被的細胞因子脂質(zhì)體混合均勻，添加凍干保護劑，得凍干粉原液，冷凍干燥后制成凍干粉；
凍干粉原液中，總蛋白濃度0.3-1mg/mL，其中外泌體蛋白質(zhì)量：脂質(zhì)體蛋白質(zhì)量＝1：10-50，所述凍干保護劑占凍干粉原液質(zhì)量的10％；
步驟5，制備黏膜適用的干粉噴霧劑：
得到的凍干粉中添加黏附材料，混合均勻，制備成干粉劑，裝入按壓式干粉噴霧瓶，即得用于陰道黏膜給藥的干粉噴霧劑；所述黏附材料占干粉劑質(zhì)量的6-30％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黏膜適用的類無針注射效果的外泌體制劑的制備方法，其特征在于，配制質(zhì)量濃度3-5％的海藻酸鈉溶液和質(zhì)量濃度2-4％的CaCl2溶液，分別滅菌，冷卻，將乳酸菌放入已滅菌的海藻酸鈉溶液中，混合均勻，接著吸取混合液，均勻滴至CaCl2溶液中，液滴表面鈣化成球，4℃交聯(lián)4-12h后，用無菌水清洗小球，得到乳酸菌-海藻酸鈉凝膠球。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黏膜適用的類無針注射效果的外泌體制劑的制備方法，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞為P3-P6代的臍帶間充質(zhì)干細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黏膜適用的類無針注射效果的外泌體制劑的制備方法，其特征在于，步驟2具體為：
將步驟1收集的上清液于300g、4℃下離心5min去除死細胞，再用0.22μm濾器過濾去除細胞碎片及其它較大粒徑的顆粒；所得濾液用截留分子量300K的超濾膜分離外泌體；超濾膜過濾所得濾液用截留分子量3-50kd的超濾膜分離細胞因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的黏膜適用的類無針注射效果的外泌體制劑的制備方法，其特征在于，步驟3中，細胞因子脂質(zhì)體溶液的具體制備方法如下：將細胞因子復(fù)配藥物，所得混合溶液注入攪拌狀態(tài)下的液體磷脂中，注入速度1-4％V/min，液體磷脂攪拌速度800-1000rpm/min，磷脂最終質(zhì)量濃度0.05-0.5％，完成后繼續(xù)攪拌5-10min，然后進行均質(zhì)處理，得到細胞因子脂質(zhì)體溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的黏膜適用的類無針注射效果的外泌體制劑的制備方法，其特征在于，步驟3中，S層蛋白濃縮液的具體制備方法如下：將所述乳酸菌-海藻酸鈉凝膠球用55mmol/L的檸檬酸鈉溶液裂解，收集乳酸菌，接種至液體培養(yǎng)基中，無氧環(huán)境培養(yǎng)1-3d，將菌液在3000rpm轉(zhuǎn)速下離心15min，收集菌體并用PBS緩沖液清洗；向每1g濕重的菌體沉淀中加入15ml的5M氯化鋰溶液，常溫振蕩30min；15000rpm下離心10min后收集上清，置于透析袋中透析，然后濃縮，得到S層蛋白濃縮液；
將S層蛋白濃縮液配置成0.01-0.1mg/mL的溶液，與等體積細胞因子脂質(zhì)體溶液混合均勻，使S層蛋白與磷脂的質(zhì)量比為1：5，混合液于4℃放置24h，得到S層蛋白包被的細胞因子脂質(zhì)體。
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