[發(fā)明專利]一種快速檢測病毒基因組大小的方法及試劑盒在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202111211637.1 | 申請日： | 2021-10-18 |
| 公開（公告）號： | CN113862257A | 公開（公告）日： | 2021-12-31 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 羅光佐;孟緣 | 申請（專利權(quán)）人： | 南京貝思奧生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;C12Q1/686;C12Q1/70 |
| 代理公司： | 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218 | 代理人： | 傅婷婷;徐冬濤 |
| 地址： | 210000 江蘇省南京市江北新區(qū)新錦*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 快速 檢測 病毒 基因組 大小 方法 試劑盒 | ||
本發(fā)明公開了一種快速檢測病毒基因組大小的方法及試劑盒。所述的方法是將病毒的基因組單鏈DNA變?yōu)楦臃€(wěn)定的雙鏈DNA后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；所述的病毒選自細(xì)小病毒科(Parvoviridae family)病毒。本發(fā)明提供的病毒基因組檢測方法及試劑盒能夠提供更為清晰的電泳成像結(jié)果，兼具條帶提亮、背景值降低以及減少樣品殘留孔道等優(yōu)勢。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測病毒基因組的試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)
最近幾年來，基因治療取得了突破性進(jìn)展。為了保證基因藥物的藥效和穩(wěn)定性，基因藥物(即重組病毒)的質(zhì)量控制極為重要。重組腺相關(guān)病毒(recombination adeno-associated virus,rAAV)已在基因治療領(lǐng)域廣泛使用了數(shù)十年，并已廣泛用于眼部疾病，神經(jīng)肌肉疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，被用來做為基因治療的一種安全而高效的基因?qū)胼d體。目前的重組腺相關(guān)病毒基因藥物的生產(chǎn)方法相比20年前有很大提高，但是其質(zhì)量控制方法的改進(jìn)則非常有限，這可能與基因治療在過去的商業(yè)化進(jìn)展緩慢有關(guān)。
眾所周知，AAV由蛋白衣殼和單鏈基因組DNA組成。先前的研究表明，通過常規(guī)的方法提取腺相關(guān)病毒的基因組DNA時，所得到的DNA為正單鏈DNA、負(fù)單鏈DNA。傳統(tǒng)的檢測腺相關(guān)病毒基因組大小主要通過Southern blot實(shí)現(xiàn)，這一方法步驟復(fù)雜、成本高，而且還必須使用用放射性同位素，不適合用作基因藥物的質(zhì)量控制方法。此外，由于這些DNA為單鏈，容易形成各種不同的二級結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其在常規(guī)瓊脂糖凝膠上遷移速率不穩(wěn)定，無法成為質(zhì)量控制的有效手段，因此必須使用變性瓊脂糖凝膠電泳，使得這些DNA都變成單鏈后才能判斷其分子量大小，使得實(shí)驗(yàn)方法變得非常繁瑣，而且由于必須使用變性膠，對實(shí)驗(yàn)條件的要求也增加。目前慣用于的質(zhì)量控制方式為銀染檢測蛋白衣殼和實(shí)時定量PCR檢測病毒基因組數(shù)量，但沒有一種簡單快速的方法來可視化病毒基因組DNA，基因組DNA的質(zhì)量控制作為檢測基因藥物是否獲批應(yīng)用于臨床，因此急需開發(fā)一種操作簡便的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種快速、高效、簡便，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，即可檢測出細(xì)小病毒科(Parvoviridae family)病毒的基因組大小的快速檢測試劑盒及檢測方法。
為實(shí)現(xiàn)前述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種快速檢測病毒基因組大小的方法，將病毒的基因組單鏈DNA變?yōu)楦臃€(wěn)定的雙鏈DNA后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；所述的病毒選自細(xì)小病毒科(Parvoviridae family)病毒。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述方法包括向病毒樣品中加入裂解液或其稀釋液，在合適的條件下使樣品中的病毒衣殼裂解，再使用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析；所述的裂解液以水為溶劑，選自以下任意一種：
(1)去污劑；
(2)去污劑和NaCl組成；
(3)由去污劑、NaCl以及螯合劑組成；
(4)由去污劑、NaCl、螯合劑以及其他添加劑組成；
加入裂解液后，使去污劑在系統(tǒng)中的終濃度為0.01-0.1％，NaCl在系統(tǒng)中的終濃度為0-0.2M，螯合劑在系統(tǒng)中的終濃度為0-6mM。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述的去污劑選自溫和去污劑，優(yōu)選十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚山梨醇酯20(吐溫-20)、TritonX 100、Proteinase K或其混合物；更進(jìn)一步優(yōu)選SDS。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述的螯合劑為EDTA。
作為本發(fā)明的更進(jìn)一步優(yōu)選，SDS在系統(tǒng)中的終濃度為0.03-0.1％，最優(yōu)選0.05％。
作為本發(fā)明的更進(jìn)一步優(yōu)選，NaCl在系統(tǒng)中的終濃度為0.02-0.08M，優(yōu)選0.05M。
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