[發(fā)明專利]人端粒長度檢測試劑盒及非診斷目的的檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111179445.7
• 申請日: 2021-10-11
• 公開（公告）號: CN113862343A
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 段化偉;王婷;王艷華;林楊
• 申請（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京兆君聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11333
• 代理人: 劉俊玲

本發(fā)明提供一種非診斷目的的人端粒相對長度檢測方法，包括：提取待測樣本基因組DNA，對待測樣本基因組DNA和來自不少于3000個人的全血DNA混樣標(biāo)準(zhǔn)品分別利用MMQPCR方法進(jìn)行檢測，并通過PCR反應(yīng)收集T、S信號，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣本基因組DNA的T/S比值計算得到待測樣本的人端粒相對長度；PCR反應(yīng)中以白蛋白基因作為內(nèi)參基因并使用合適的引物，控制每10μL反應(yīng)體系中含有10μM的telg引物0.36μL、10μM的telc引物0.36μL、10μM的albu引物0.06μL、10μM的albd引物0.06μL和1μL的待測樣本DNA或標(biāo)準(zhǔn)品DNA。本發(fā)明還提供用于檢測人端粒長度的試劑盒。本發(fā)明的檢測方法和試劑盒檢測準(zhǔn)確性高、操作簡便、需樣量低，適用于大樣本量的人群檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人端粒相對長度檢測試用試劑盒，及利用該試劑盒檢測人端粒長度的非診斷目的的檢測方法。

背景技術(shù)

目前，測定端粒長度的實驗方法多種多樣。其中，Southern Blot技術(shù)雖然是端粒長度測定領(lǐng)域的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于該方法樣本量需求大、操作復(fù)雜、實驗繁瑣、對實驗員的技術(shù)要求較高；PCR定量法因操作便捷、測定時間短，可廣泛應(yīng)用于人群研究，但是大部分研究采用的是分別定量單拷貝基因和端粒基因，然后根據(jù)2^-ΔΔCT相對定量的方式來表示端粒相對長度；或者測定端粒(T)信號在一組反應(yīng)、同一樣本、但不同反應(yīng)孔中單拷貝基因(S)信號，根據(jù)T/S比值與平均端粒長度成正比來達(dá)到定量的目的。

為了降低不同反應(yīng)孔多次移液加樣帶來的系統(tǒng)誤差，已有學(xué)者提出了改進(jìn)的熒光定量PCR檢測方法，在一組反應(yīng)、同一反應(yīng)孔中同時收集端粒(T)信號和單拷貝基因(S)信號。

即便如此，利用現(xiàn)有的熒光定量PCR檢測端粒長度時，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性仍然有待提高。因此有必要從多個方面優(yōu)化用于檢測端粒長度的熒光定量PCR方案，以顯著提升其檢測準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述背景，本發(fā)明一方面的目的在于：提供一種優(yōu)化的用于人端粒長度檢測的熒光定量PCR檢測方法。

本發(fā)明另一方面的目的在于：提供一種可以用于本發(fā)明上述人端粒長度檢測方法的試劑盒。

本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

首先，提供一種非診斷目的的人端粒相對長度檢測方法，包括：提取待測樣本基因組DNA，以來自不少于3000個人的全血DNA混合樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，待測樣本基因組DNA和標(biāo)準(zhǔn)品分別利用單色多重?zé)晒舛縋CR(MMQPCR)方法進(jìn)行檢測，并通過PCR反應(yīng)收集端粒熒光信號(T)和單拷貝基因熒光信號(S)；其中，標(biāo)準(zhǔn)品以涵蓋所述待測樣本基因組DNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度進(jìn)行檢測，得到T/S比值標(biāo)準(zhǔn)曲線，基于所述標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣本基因組DNA檢測得到的T/S比值計算得到待測樣本的人端粒相對長度；

其中，MMQPCR方法檢測的單拷貝基因為白蛋白(ALB)基因，作為內(nèi)參基因；所述的PCR反應(yīng)使用的引物序列如下：

本發(fā)明所述的檢測方法中，所述標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度來自一個可涵蓋所述待測樣本基因組DNA濃度的濃度值范圍，例如，該濃度值范圍可以是從待測樣本基因組DNA濃度的0.0625倍到10倍。檢測時可以將所述標(biāo)準(zhǔn)品配制成該范圍中相對均勻分布的一系列具體濃度，這一系列具體濃度中可以包含或不包含所述待測樣本基因組DNA濃度；優(yōu)選的方案中，為了提高標(biāo)準(zhǔn)曲線的參考性，所述的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度取值由不少于5個數(shù)的等比數(shù)列構(gòu)成，且大于和小于所述待測樣本基因組DNA濃度的數(shù)值均不少于2個。