[發(fā)明專利]一種用于捕獲mRNA的層析介質(zhì)及其制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202111168133.6
• 申請日: 2021-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN113797904A
• 公開（公告）日: 2021-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂小林;丁良龍;陳迪安;胡新妹;毛慧明
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州賽分科技股份有限公司
• 主分類號(hào): B01J20/285
• 分類號(hào): B01J20/285;B01J20/286;C12N15/10;B01D15/38;B01J20/30
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 冒艷

本發(fā)明公開了一種用于捕獲mRNA的層析介質(zhì)及其制備方法，結(jié)構(gòu)為SP?R?Oligo dT，SP為基礎(chǔ)介質(zhì)，Oligo dT為親和配基，R為基礎(chǔ)介質(zhì)偶聯(lián)Oligo dT的間隔臂。(1)將基礎(chǔ)介質(zhì)活化，得到表面修飾有大量環(huán)氧基或醛基的活化介質(zhì)；(2)將Oligo dT偶聯(lián)至活化介質(zhì)上；(3)將多余醛基或環(huán)氧基封閉處理，得到Oligo dT親和介質(zhì)。本發(fā)明的介質(zhì)剛性好、表面親水性好、載量高，適用于mRNA預(yù)防和治療生物制品的下游純化。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及層析介質(zhì)及其制備方法，特別涉及一種用于捕獲mRNA的層析介質(zhì)及其制備方法。

背景技術(shù)

早在上世紀(jì)90年代，科學(xué)家就將體外合成的mRNA注射入小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其能夠在小鼠體內(nèi)被翻譯成相關(guān)的活性蛋白，并產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，可以發(fā)揮疫苗的作用，這便是mRNA疫苗的雛形。但由于技術(shù)所限，mRNA在穩(wěn)定性、安全性以及藥物呈遞方面存在諸多瓶頸。經(jīng)過30年的發(fā)展，mRNA的合成、修飾、遞送技術(shù)有了長足的進(jìn)步，特別是新冠病毒的大流行，促使人類歷史上第一款mRNA疫苗被批準(zhǔn)用于疾病預(yù)防，在有效性方面mRNA疫苗明顯高于傳統(tǒng)技術(shù)疫苗，這直接促進(jìn)了mRNA預(yù)防和治療產(chǎn)品的快速發(fā)展。

傳統(tǒng)的mRNA生產(chǎn)制備方法需要很多純化步驟，使用大量的有害試劑，因此對于大規(guī)模生產(chǎn)的下游純化階段是一個(gè)非常不利的因素。目前業(yè)內(nèi)常用的mRNA純化方法包括反相、親和、離子交換及分子篩等，反向色譜是使用較為廣泛的方法，但該方法的載量較低，并需要使用易燃、有毒有害的溶劑。而離子交換層析和分子篩純化應(yīng)用卻受限于較差的選擇性和較低的載量。

根據(jù)目前相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，大多數(shù)mRNA產(chǎn)品在修飾過程中都會(huì)有一個(gè)PolyA尾巴，長度可達(dá)250nt，這為后續(xù)純化帶來了很大的便利。將一定長度的堿基T作為配基鍵合至固相載體上，可通過T和A之間的堿基配對作用捕獲mRNA，這不僅可以去除絕大多數(shù)的工藝相關(guān)雜質(zhì)，如DNA模板、RNA聚合酶等，還可以去除產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，如沒有PolyA尾巴的mRNA。當(dāng)配基為單鏈多聚胸腺嘧啶時(shí)，其與mRNA的Poly(A) 尾巴結(jié)合過強(qiáng)，不容易洗脫，因此可以采用結(jié)合能力較弱的單鏈多聚脫氧胸腺嘧啶作為配基，相關(guān)產(chǎn)品包括鍵合有Oligo dT的磁珠、纖維素、聚乙烯-二乙烯基苯微球等。在這些產(chǎn)品中，磁珠由于原理所限，只能用于實(shí)驗(yàn)室研究，提純少量mRNA；纖維素由于基質(zhì)太軟，不利于mRNA產(chǎn)品下游大規(guī)模純化；而聚乙烯-二乙烯基苯微球剛性好，可用于mRNA產(chǎn)品的工業(yè)純化，但由于其表面疏水性較強(qiáng)，其它雜質(zhì)可通過疏水作用結(jié)合到微球上，在后續(xù)的洗脫步驟混入mRNA產(chǎn)品中，雜質(zhì)去除效果不理想。隨著生物制藥技術(shù)的發(fā)展，層析技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于生物大分子藥物下游的大規(guī)模純化，因此，有必要開發(fā)一種剛性好、表面親水性好、載量高、易使用的Oligo dT親和層析介質(zhì)，專門用于mRNA預(yù)防和治療生物制品的下游純化。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明目的是提供偶聯(lián)效率高的用于捕獲mRNA的層析介質(zhì)。

本發(fā)明另一目的是提供所述偶聯(lián)效率高的用于捕獲mRNA的層析介質(zhì)的制備方法。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供一種用于捕獲mRNA的層析介質(zhì)，結(jié)構(gòu)如下：

SP-R-Oligo dT

其中，SP為基礎(chǔ)介質(zhì)，Oligo dT為親和配基，R為基礎(chǔ)介質(zhì)偶聯(lián)Oligo dT的間隔臂。在這一結(jié)構(gòu)中，基礎(chǔ)介質(zhì)作為Oligo dT配基的固體支撐物，具有合適的孔結(jié)構(gòu)，可以提供足夠大的比表面積，用于提高mRNA的結(jié)合載量，此外，基礎(chǔ)介質(zhì)表面還具有極好的親水層，盡可能降低雜質(zhì)的非特異性結(jié)合。Oligo dT為單鏈多聚脫氧胸腺嘧啶，用于結(jié)合具有PolyA尾巴的mRNA。間隔臂R的作用為將Oligo dT配基偶聯(lián)至固體支撐物上，在結(jié)合-洗脫模式的純化步驟中盡可能避免配基混入產(chǎn)品中，同時(shí)，間隔臂R選用親水性好的試劑，降低雜質(zhì)的非特異性結(jié)合。