[發明專利]一種體外受精優化方法及其在動物大量快速繁殖中的應用

在審

• 申請號: 202111144689.1
• 申請日: 2021-09-28
• 公開（公告）號: CN113817668A
• 公開（公告）日: 2021-12-21
• 發明（設計）人: 張靜;常在;侯金蓮;呂珊
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075;C12N5/076
• 代理公司: 北京知聯天下知識產權代理事務所(普通合伙) 11594
• 代理人: 張迎新

本發明提供了一種體外受精(In vitrofertilization，IVF)優化方法及其在動物中大量快速繁殖中的應用，使用該方法能顯著提高體外受精后的卵裂率和生仔率，本發明還提供了一種受精培養液(HTFG)，包含該受精培養液的體外受精體系可以提高精子體外受精的卵裂率和生仔率。

技術領域：

本發明屬于輔助生殖技術領域，具體涉及一種體外受精優化方法及其在動物大量快速繁殖和保種中的應用。

背景技術：

基于科研和應用研究對所需C57BL/6小鼠(以下簡稱B6小鼠)品系的多種技術服務需求中，大量快速擴群繁殖尤為重要，其中冷凍精子品系的短時間大量獲得活體小鼠更受關注。

目前針對小鼠快速擴群生產的方法主要包括交配擴繁和體外受精(In VitroFertilization，以下簡稱IVF)生產兩種方式，其中基于IVF體系的輔助生殖技術具有快速、高效、節約成本、對小鼠的質量要求較低等優點。IVF是體外生產技術中的核心步驟，在大量快速繁殖中起著至關重要重要的作用。正常受精過程包括精卵識別、精卵結合、精卵融合和父母雙方基因組的有序整合等等。IVF技術的重點內容是精子體外獲能。目前，精子體外獲能方法在許多物種已相當成熟。在一個穩定的獲能體系中，精子質量和精子濃度常常是影響IVF技術的變量因素。IVF技術的實驗操作時間雖然不長，但也可能產生一些重要問題，比如多精受精(Polyspermy)，這一現象使得胚胎遺傳物質的組成發生異常，導致胚胎發育率低。多精受精可能是由于精子濃度高造成，但也和卵細胞的成熟質量有關。還有研究表明微管微絲(Microfilaments)也影響著受精過程中紡錘體的旋轉、精卵結合、皮質顆粒的分泌、第二極體的排出等一系列活動。在小鼠的精卵結合中，發現微絲微管的調節器JAS(Jasplakinolide)發揮著抑制作用。有研究報道在精卵結合中，與細胞骨架有關的ρ蛋白利于受精的發生。小鼠的IVF胚胎也存在一定的發育缺陷，特別是多精受精導致的胚胎異常發育對于小鼠IVF的效率影響很大，因此研究小鼠IVF胚胎發育過程中如何降低多精受精率，提高IVF胚胎卵裂率和發育率具有重要的實用價值。

傳統的哺乳動物自然交配繁育技術受很多因素的影響，如動物性別、周齡和自身營養狀態等。隨著輔助生殖技術的發展，精子體外獲能方法和胚胎體外培養體系在許多物種已相當成熟，但IVF技術的重點內容是提高精子體外獲能和降低胚胎畸形率。在一個穩定的體外受精體系中，培養液常常是影響IVF技術的變量因素。

在體外受精過程中，一些物質被添加進受精液中以提高精子活力。GSH作為精子和卵細胞主要的非蛋白類抗氧化物質，具有提高精子活力，清除受精液中的ROS，調節精子中cAMP水平等作用。因此，在受精液中添加GHS能夠提高受精后胚胎發育能力。

朱佳偉在其研究中發現，在小鼠體外受精中，通過在各個GSH添加組中受精后的卵裂率只有當GSH的濃度為300毫摩爾時才有較明顯的提高，而其他各組之間差異不顯著，從而認為低濃度的GSH并不能很高地保護精子使其免受ROS的傷害(“GSH對小鼠卵細胞體外受精成熟體外受精的影響”，碩士學位論文，東北農業大學，2008年)。

但是高濃度的GSH也會起到相反的作用。Boquest AC等(1999)的研究表面，在牛受精液中添加500微升的GSH會降低囊胚發育率。Jeong BS等(2001)也發現，在豬受精液中添加高濃度的GSH會降低卵裂率和囊胚率。因此降低對GSH的依賴也同時提高卵裂率和囊胚率。因此，尋找GSH濃度的最優范圍是一個值得努力的方向。

并且，受精胚胎的卵裂依賴于培養體系的營養成分和PH值等，目前已成為亟待解決的問題。

發明內容：

本發明目的在于尋找一種更好的體外快速繁殖和保種的體系，提高受精和早期胚胎的質量，為動物的體外生產技術和輔助生殖技術提供優化的方案，提高繁育速度，縮短獲得實驗材料的時間，加速科研進程。

本發明的第一方面，提供了一種受精培養液(HTFG)，所述的受精培養液包含受精液(HTF)和可選的包括還原型谷胱甘肽(GSH)。