[發(fā)明專利]一種篩查紅系轉(zhuǎn)錄因子EKLF基因突變的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111136730.0
• 申請日: 2021-09-27
• 公開（公告）號: CN113621700B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉頓;余麗華;劉風(fēng)華;張曦倩
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省婦幼保健院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標(biāo)代理有限公司 21107
• 代理人: 史力伏

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種篩查紅系轉(zhuǎn)錄因子EKLF基因突變的方法及其應(yīng)用。其特點是根據(jù)EKLF基因序列設(shè)計擴增引物，利用優(yōu)化的高分辨率熔解曲線反應(yīng)體系針對樣本中EKLF基因未知突變進行篩查。本發(fā)明提供的檢測方法操作簡單、速度快、通量高、PCR產(chǎn)物無需后處理、可以檢測出單個堿基的差異、真正實現(xiàn)閉管操作，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種篩查紅系轉(zhuǎn)錄因子EKLF基因突變的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

紅系轉(zhuǎn)錄因子EKLF/KLF1最早由美國西奈山醫(yī)學(xué)院科學(xué)家Bieker發(fā)現(xiàn)，它通過特異性的識別結(jié)合保守的DNA序列啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)紅細胞一系列的生長發(fā)育過程。EKLF基因（NC_000019.10）位于19p13.2，全長2781bp，含有三個外顯子，兩個內(nèi)含子，蛋白由2個功能域組成：一個位于N端，是由脯氨酸富集的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域；另一個位于C端，是結(jié)合保守DNA序列的鋅指結(jié)構(gòu)域。研究顯示EKLF基因顯性突變或雙重突變可導(dǎo)致一系列血液病表型，而EKLF基因單等位基因的突變可以導(dǎo)致一系列的良性表型，如胎兒血紅蛋白HbF和成人血紅蛋白A2（HbA2）升高等，進而對b-地中海貧血臨床表型產(chǎn)生表型修飾作用。

篩查基因未知突變的方法主要有變性高效液相色譜（DHPLC），單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP），Sanger測序法（金標(biāo)準(zhǔn)）以及下一代測序等。但是這些檢測方法或多或少的存在操作步驟繁瑣，檢測周期長，檢測成本較高等缺點。高分辨率熔解曲線（High resolutionmeltinganalysis，HRM）技術(shù)是一種可以實現(xiàn)高通量并獲得可靠結(jié)果的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法。HRM篩查突變的主要原理是根據(jù)不同核酸分子的片段長短、GC含量、堿基互補配對存在差異性，使得PCR產(chǎn)物在加熱變性時，即使單個堿基的變化足以影響片段使解鏈溫度（Tm值）存在差異，雙鏈DNA分子同時形成獨特的熔解曲線的形狀和位置，從而根據(jù)熔解曲線的不同來對樣品進行區(qū)分，最終對篩查出的突變的陽性樣本進行Sanger測序確認。

因此應(yīng)用HRM篩查EKLF基因突變具有重要的應(yīng)用價值，目前篩查方法最常見是Sanger測序法，實驗分步進行，所需配備試劑復(fù)雜，耗時耗力，經(jīng)濟成本高，容易污染，不適用于大規(guī)模人群篩查，所以探索一種適用大規(guī)模人群篩查EKLF基因突變的方法及檢測試劑盒已經(jīng)成為臨床實驗研究的熱點問題。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用HRM技術(shù)檢測EKLF基因未知突變的檢測試劑盒，以解決上述背景技術(shù)中提出的目前檢測使用的試劑原料需多方配備，實驗操作步驟繁瑣，耗時較長，容易污染，檢測成本較高等問題。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案。

本發(fā)明提供一種以高分辨率熔解曲線技術(shù)為基礎(chǔ)檢測EKLF基因突變的PCR引物組，其特征在于，所述引物組包括9對引物，詳述如下：

（1）EKLF基因啟動子區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；

（2）EKLF基因外顯子1區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

（3）EKLF基因外顯子2-1區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

（4）EKLF基因外顯子2-2區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；

（5）EKLF基因外顯子2-3區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；

（6）EKLF基因外顯子2-4區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；

（7）EKLF基因外顯子3區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；

（8）EKLF基因3'UTR-1區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；